克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)”，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆”，即通過重組技術(shù)將目的dna片段按照人們的設(shè)計定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
前兩期小翌給小伙伴們介紹了一些傳統(tǒng)的、應(yīng)用范圍廣的、新型的分子克隆方法。相信大家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、ta克隆、gatway克隆、topo克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟，接下來小翌就具體解析一下載體和目的片段制備的過程，為您的實驗提供好方法。
圖1.無縫克隆關(guān)鍵步驟
01目的片段制備目的片段：目的片段來源為基因組dna、另一質(zhì)粒的一部分或者線性dna片段等。制備目的片段時常用的方法有兩種，方法一是通過pcr擴(kuò)增片段或者載體上的目的序列，在此過程中，如果制備目的片段是為了在下游進(jìn)行傳統(tǒng)的酶切酶連方式，就需要引入限制性酶切位點，設(shè)計與線性載體兩端相同的酶切位點，以便酶切后通過匹配的粘性末端進(jìn)行連接；如果制備目的片段是為了在下游進(jìn)行同源重組，則需要引入15-25 bp的上下游同源臂。
方法一首先，通過翌圣的無縫克隆引物設(shè)計軟件 設(shè)計引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點，生成引物，如圖2所示。
圖2.翌圣引物設(shè)計流程
值得注意的是，多個目的片段插入的雙酶切位點，實際添加到第一個片段的5’端和最后一個片段的3’端，中間片段不含有設(shè)計的酶切位點。之后，通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著，利用pcr技術(shù)擴(kuò)增目的片段，如使用翌圣高保真pcr試劑盒（cat#10164es），包含高保真dna聚合酶，擴(kuò)增目的片段快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)；或使用翌圣快速pcr試劑盒（cat#10157es），3 kb以內(nèi)基因組等復(fù)雜模板擴(kuò)增速度可達(dá)1-3 sec/kb，5 kb以內(nèi)質(zhì)粒等簡單模板擴(kuò)增速度可達(dá)1 sec/kb，具有taq dna聚合酶，擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物具有3’-da突出端，可輕松克隆至t載體。
方法二通過限制性內(nèi)切酶，對質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切，獲得需要的目的片段，直接應(yīng)用于下游的載體片段連接，如topo克隆技術(shù)，翌圣通用型topo克隆試劑盒（cat#10906es）不受酶切后的平末端或粘性末端的影響，僅需5 min就能連上載體，市場反饋效果好，南京某高校利用10906es連接2000 bp（50 ng）粘性末端片段，陽性克隆率達(dá)100%，如圖3所示。
圖3. 10906es連接2000 bp（50 ng）粘性末端片段圖
a：載體和片段均來自南京某高校；b：插入片段pcr鑒定電泳圖
擴(kuò)增后產(chǎn)物需要進(jìn)行純化。有兩種方法，一種是使用翌圣瓊脂糖（cat#10208es）配制凝膠，電泳后切割出目標(biāo)片段進(jìn)行純化，如使用翌圣的瓊脂糖凝膠回收試劑盒（cat#19101es）能保證實驗流程高效、結(jié)果可靠、得率高。另一種是直接取pcr產(chǎn)物純化，如使用翌圣pcr產(chǎn)物純化試劑盒（cat#19106es），操作簡便，15 min即可完成pcr產(chǎn)物純化。
02載體制備載體：將目的dna序列通過基因工程手段送到受體細(xì)胞所需的運載工具。常見的載體有質(zhì)粒，病毒和噬菌體。當(dāng)前基因工程中的載體是質(zhì)粒。
所有基于質(zhì)粒的克隆載體包括：確保在細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)能有效增殖的復(fù)制原；單一酶切位點，或多克隆位點（mcs），后者含有一系列酶切位點，可供目的片段插入；載體成功轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌篩選標(biāo)記（例如，抗生素耐受）。
pet系列載體是目前應(yīng)用泛的重組蛋白表達(dá)載體，載體構(gòu)建時目的片段被克隆入載體噬菌體t7轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)下，經(jīng)轉(zhuǎn)化在宿主t7 rna聚合酶的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。t7 rna聚合酶具有并特異的啟動t7啟動子基因表達(dá)功能，當(dāng)其被誘導(dǎo)時，可使宿主本身的表達(dá)幾乎全部轉(zhuǎn)化為目的基因的表達(dá)，誘導(dǎo)幾個小時后即可使得最終目的基因表達(dá)產(chǎn)物超過細(xì)胞總蛋白的50%。
翌圣pet-28a(+) vector表達(dá)載體（cat#11905es）載體帶有一個n端的his/thrombin/t7蛋白標(biāo)簽，同時含有一個可以選擇的c端his標(biāo)簽，還有單一的多克隆位點，方便目的片段的克隆與表達(dá)，載體圖譜如圖4所示。
圖4. 翌圣pet-28a(+) vector表達(dá)載體圖譜
準(zhǔn)備好載體后，即可進(jìn)行載體的制備。其與目的片段制備方法相同，可通過pcr擴(kuò)增或限制性內(nèi)切酶酶切獲得線性化載體。限制性內(nèi)切酶的選擇取決于載體和插入片段上是否存在相應(yīng)的識別序列、識別序列的位置以及是否適于連接。mcs往往是插入片段的，因為該區(qū)域?qū)Ｓ糜诳寺 ?br>翌圣的funicut™快速限制性內(nèi)切酶能快速、精準(zhǔn)完成dna切割。載體酶切后，為防止自連，有必要進(jìn)行載體的去磷酸化，尤其當(dāng)載體酶切后末端可互補(bǔ)或是平端時。載體的去磷酸化對于降低背景、促進(jìn)所需片段插入載體非常重要，翌圣小牛腸堿性磷酸酶（cat#10321es）可將dna、rna的5’端磷酸基團(tuán)去除，有效阻止載體的自連現(xiàn)象。獲得的線性化載體也需要純化回收后使用。
圖5.小牛腸堿性磷酸酶去dna磷酸化示意圖
經(jīng)過上述步驟，載體和目的片段都已整裝待發(fā)，是時候開展下一步的載體和片段連接反應(yīng)了。那么連接反應(yīng)中應(yīng)用到的技術(shù)和試劑又有哪些呢？關(guān)注我們，小翌會在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解分子克隆連接中應(yīng)用到的技術(shù)，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
03相關(guān)產(chǎn)品列表產(chǎn)品定位
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品貨號
規(guī)格
5s/kb，高保真pcr（含上樣染料）
2× hieff canace® advancefast pcr master mix (with dye)
10164es03/08
1 ml/5×1 ml
快速pcr，快至1s/kb
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1 ml/5×1 ml
常規(guī)pcr
2×hieff®pcr master mix(with dye)
10102es03/08
1 ml/5×1 ml
兼容ta/平末端克隆
hieff clone® universal zero topo ta/blunt cloning kit
10906es08/20
5 t/20 t
高質(zhì)量瓊脂糖
agarose瓊脂糖
10208es60/76
100 g/500 g
瓊脂糖凝膠回收試劑盒
molpure® gel extraction kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒
19101es50/70
50 t/200 t
pcr產(chǎn)物純化試劑盒
molpure® pcr purification kit pcr產(chǎn)物純化試劑盒
19106es50/70
50 t/200 t
表達(dá)載體
pet-28a(+) vector 表達(dá)載體
11905es03
1 μg
去dna磷酸化
alkaline phosphatase(30 u/μl),calf intestine(ciap) 小牛腸堿性磷酸酶
10321es80
1000 u
通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切
funicut™快速限制性內(nèi)切酶
15001es-15051es
50 t