光學(xué)顯微鏡的使用及示教片的觀察 一、實驗?zāi)康?1、學(xué)習(xí)和掌握油杯的使用原理和方法。 2、復(fù)習(xí)普通臺式顯微鏡各部分的結(jié)構(gòu)、功能和使用方法。 2、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和油鏡的工作原理?，F(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡采用目鏡和物鏡兩種透鏡系統(tǒng)進行放大成像，因此常被稱為復(fù)合顯微鏡。它們由兩部分組成：機械裝置和光學(xué)系統(tǒng)。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。在普通光學(xué)顯微鏡常用的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最大，是微生物研究中最重要的。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需要在載玻片和鏡頭之間加一滴鏡頭油。這主要是以下兩個原因： 1. 增加照明油透鏡的亮度，放大倍數(shù)可以達到100 χ，這么大的放大倍數(shù)的鏡頭焦距短，直徑小，但所需的光強是最大的。載有標本的載玻片發(fā)出的光，由于介質(zhì)密度不同（從載玻片進入空氣，再進入透鏡），部分光線會因折射或全反射而無法進入透鏡，導(dǎo)致使用油鏡由于光線較少，物體的圖像不清晰。因此，為了不損失通過的光線，在使用油鏡時，必須在油鏡和玻璃（通常是雪松油，其折射率為指數(shù)為 n = 1.52）。 2、提高顯微鏡的分辨率 顯微鏡的分辨率或分辨力是指顯微鏡分辨兩點之間最小距離的能力。從物理角度來看，光學(xué)顯微鏡的分辨率受光干涉現(xiàn)象和所用物鏡性能的限制。分辨率d可以表示為：d=λ/2n.a，其中λ=光的波長； na=物鏡數(shù)值孔徑值。光學(xué)顯微鏡的光源不能超過可見光的波長范圍（0.4-0.7μm），數(shù)值孔徑值取決于物鏡的透鏡角度和載玻片與透鏡之間介質(zhì)的折射率，可表示為： na=n × 在sin α的公式中，α為光最大入射角的一半。這取決于物鏡的直徑和焦距。一般來說，實際應(yīng)用中只能達到120 o，n為介質(zhì)的折射率。由于雪松油的折射率 (1.52）高于空氣和水的折射率（分別為1.0和1.33），所以以雪松油為介質(zhì)的鏡片與玻璃之間的油鏡所能達到的數(shù)值孔徑值（na一般為1.2-1.4）為更高 適用于低倍鏡和高倍鏡（na低于1.0）等干式鏡片。如果以可見光的平均波長0.55μm計算，數(shù)值孔徑通常在0.65左右的高倍透鏡只能分辨距離不小于0.4μm的物體，而油性透鏡的分辨率可以達到0.2μm左右.三、實驗設(shè)備 1、菌株：枯草芽孢桿菌染色玻片標本。青霉菌（penicillium sp.）水封等（教師可根據(jù)具體情況選擇菌種）。 2、溶液或試劑：雪松油、乙醇：yi醚混合物 3、儀器或其他用具：顯微鏡、擦鏡紙等 4、操作步驟 1、觀察前的準備 （1）顯微鏡的放置：將顯微鏡放在平板實驗臺，鏡頭卡口距實驗臺邊緣約3-4cm。顯微鏡檢查時姿勢應(yīng)正確。用一只手握住顯微鏡的臂，另一只手握住底座，以保持顯微鏡直立和穩(wěn)定。不要用一只手搬運；無論您使用單目顯微鏡還是雙目顯微鏡，都應(yīng)同時睜開雙眼進行觀察，以減少眼睛疲勞，同時也便于在繪圖或記錄時進行觀察。 (2)光源調(diào)節(jié)：安裝在鏡架上的光源燈可以通過電壓調(diào)節(jié)，以獲得合適的照明亮度，當(dāng)使用反射器收集自然光或光作為照明光源時，應(yīng)根據(jù)光源的強度和物鏡的放大倍數(shù)采用凹面或凸面反射鏡并調(diào)整其角度，使視場內(nèi)光線均勻，亮度適宜。 (3)根據(jù)用戶的個人情況調(diào)整雙目顯微鏡的目鏡。雙目顯微鏡的目鏡間距可以適當(dāng)調(diào)節(jié)，左目鏡一般配有屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，可以適應(yīng)不同的眼距或視力。不同觀察者的差異。 (4)聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)聚光器的光圈孔徑值，使其與物鏡的數(shù)值孔徑值一致或略低。有些顯微鏡的聚光鏡只標注了最大數(shù)值孔徑值，并沒有具體的孔徑刻度。使用本顯微鏡時，可以在樣品聚焦后取下目鏡，在從鏡筒觀察視野的同時放大光圈。調(diào)整光圈邊緣與物鏡黑圈相切或略小于其邊緣。.由于每個物鏡的數(shù)值孔徑不同，每次更換物鏡時都要進行這種調(diào)整。聚光鏡的數(shù)值孔徑值確定后，如果需要改變光強，可以通過升降聚光鏡或改變光源的亮度來實現(xiàn)。原則上不應(yīng)通過虹彩光圈進行調(diào)整。當(dāng)然，虹彩光圈的使用原理、聚光鏡的高度和照明光源的強度都不是固定的。只要能獲得良好的觀察效果，有時可以根據(jù)不同的具體情況靈活使用，不一定是固定的。 2、對于顯微觀察，在目鏡不變的情況下，不同倍率物鏡所能達到的分辨率和放大倍數(shù)是不同的。一般情況下，特別是初學(xué)者，在進行顯微觀察時，應(yīng)遵循從低倍到高倍再到油鏡的觀察程序，因為低倍物鏡的視場比較大，容易找到目標和確定檢查位置。 (1)低倍觀察金黃色葡萄球菌染色標本。將載玻片放在載物臺上，用樣品夾夾住，移動推進器，使觀察對象直接位于物鏡下方。降低 10x 物鏡使其靠近樣品。用粗調(diào)器慢慢抬起鏡筒，使標本初步聚焦在視野內(nèi)，然后用微調(diào)器將圖像調(diào)得清晰。緩慢移動載玻片通過載玻片夾推桿，仔細觀察標本的各個部位，找到合適的目標，仔細觀察并記錄觀察結(jié)果。任何時候用粗調(diào)器對圖像進行調(diào)焦時，要養(yǎng)成從側(cè)面仔細調(diào)整靠近標本的物鏡*的習(xí)慣，然后用目鏡觀察，慢慢調(diào)整遠離標本的物鏡準直，以免暫時誤操作。損壞鏡頭和載玻片。 (2) 用高倍鏡觀察。在低倍鏡下找到合適的觀察目標并將其移至視野中心后，輕輕轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)盤，將高倍鏡移至工作位置。適當(dāng)調(diào)整聚光器孔徑和視野亮度后，微調(diào)微調(diào)器使物像清晰，用螺旋槳移動試樣仔細觀察并記錄觀察結(jié)果。一般情況下，當(dāng)物像已經(jīng)在物鏡中清晰聚焦后，物鏡轉(zhuǎn)至工作位置觀察時，物像基本保持在焦點上。這種現(xiàn)象稱為物鏡共焦（parfocal）。利用這種共焦現(xiàn)象，可以保證在使用高倍率或高倍率短工作距離的油鏡時，僅用微調(diào)器就可以清晰聚焦物像，避免使用粗調(diào)器的可能.誤操作損壞鏡頭或載玻片。 (3)油鏡觀察高倍鏡或低倍鏡找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)器將鏡筒抬高，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)加一滴雪松油，從側(cè)面看，用粗調(diào)器小心地降低鏡筒，使油鏡浸入鏡油中，幾乎與鏡筒接觸。標本。將聚光鏡升至最高位置并打開全孔徑。如果使用的冷凝器的數(shù)值孔徑超過 1.0，請在冷凝器和載玻片之間加入一滴雪松油，以確保其最大效率。調(diào)整照明，使視野的亮度合適。使用粗調(diào)器緩慢抬起鏡筒，直到視野中出現(xiàn)物體圖像，然后使用微調(diào)器使其清晰對焦。有時按上述操作找不到目標物體，可能是油鏡沒有降到位，或者油鏡升得太快，使眼睛無法捕捉到經(jīng)過物體的圖像。在這種情況下，您應(yīng)該重新操作。此外，要特別注意不要在降低鏡頭時用力過大或在調(diào)整焦距時錯誤地將粗調(diào)器向相反方向轉(zhuǎn)動而損壞鏡頭和載玻片。三、顯微鏡使用后的處理 (1) 抬起鏡筒，取下載玻片。 (2)用擦鏡紙擦去鏡頭上的擦鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（雪松油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油，最后用干凈的鏡頭清潔紙 去除殘留的二甲苯。 (3)用鏡頭清潔紙清潔其他物鏡和目鏡；用絲布清潔顯微鏡的金屬部分。 (4)還原各部分，反射鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，然后向下旋轉(zhuǎn)。同時，降低聚光鏡以避免物鏡和聚光鏡碰撞的風(fēng)險。五、實驗報告 1、畫出你在低倍、高倍和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和青霉菌的形態(tài)，包括三種情況下的視野品種。還要注明物鏡放大倍數(shù)和總放大倍數(shù)。六、問題 1、用油鏡觀察時應(yīng)注意哪些問題？載玻片和鏡片之間加什么油？它扮演什么角色？ 2、測試單比較了低倍鏡、高倍鏡和油鏡的區(qū)別。為什么在使用高倍鏡和油鏡時要特別注意避免粗調(diào)器誤操作？ 3、物鏡的共焦現(xiàn)象是什么？它在顯微觀察中有什么意義？ 4、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ 5.根據(jù)你的實驗經(jīng)驗，談?wù)勅绾胃鶕?jù)觀察微生物的大小選擇不同的物鏡進行有效觀察。