蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗體
背景
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗體是一類可以特異性結(jié)合蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的多克隆抗體，主要用于體外檢測蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的wb、elisa、ip、if、ihc等免疫學實驗。
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，細胞甲狀腺激素結(jié)合蛋白(p55)是一種外周膜蛋白，屬于蛋白二硫鍵異構(gòu)酶家族。
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗體免疫組化
分泌蛋白需要通過在分子內(nèi)或分子間形成二硫鍵，從而形成其天然構(gòu)象。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶，可以催化這些二硫鍵的形成和異構(gòu)化。pdi一方面可以通過二硫鍵異構(gòu)酶活性促進蛋白內(nèi)或蛋白間形成正確的二硫鍵，另一方面也可以催化某些蛋白的二硫鍵的水解。
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，pdi）是巰基異構(gòu)酶家族的原型成員，具有促進蛋白質(zhì)二硫鍵的形成及異構(gòu)化、氧化還原和分子伴侶等多種作用。pdi初發(fā)現(xiàn)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，近些年研究發(fā)現(xiàn)pdi也廣泛存在于細胞表面和細胞外基質(zhì)中，并且這些特殊位置的pdi在多種病理生理過程發(fā)揮重要調(diào)控作用。在本篇綜述中，方超教授團隊系統(tǒng)闡釋了pdi的分子結(jié)構(gòu)、pdi在細胞表面和細胞外的分布及外化機制；細致探討了影響細胞表面和細胞外pdi活性的因素；系統(tǒng)介紹了細胞表面和細胞外pdi通過多種分子機制參與血栓形成、腫瘤、免疫炎癥、血管重構(gòu)、紅細胞生理和鐮狀紅細胞貧血等多種病理生理過程。
應(yīng)用
用于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶對畢赤酵母分泌淀粉樣蛋白的影響研究
研究表明pdi基因是釀酒酵母的必需基因,敲除pdi會使釀酒酵母致死,而畢赤酵母和釀酒酵母基因組具有非常高的相似性,由此采用與pdi結(jié)構(gòu)非常相似的mpdi基因代替pdi基因進行敲除從而避免酵母的致死情況。
研究通過同源重組的方法構(gòu)建敲除載體,運用電轉(zhuǎn)方法將其導(dǎo)入畢赤酵母中使之自發(fā)地發(fā)生同源重組,使目的基因失活。隨后,將用于表達外源蛋白的重組質(zhì)粒載體p piczαa-α-syn和p piczαa-c c通過電穿孔法分別轉(zhuǎn)至正常畢赤酵母gs115菌株、敲除mpdi的畢赤酵母菌株gs115-δmpdi菌株中,從而得到四種重組菌株。通過免疫印跡反應(yīng)檢測這兩種淀粉樣蛋白在兩種畢赤酵母菌株中的表達差異。另一方面,對pdi過表達的畢赤酵母菌株中野生型雞胱抑素c（wt）及其淀粉樣突變體i66q、不穩(wěn)定型截短突變體δw的表達量進行rna測序分析,找出參與蛋白表達、蛋白降解的關(guān)鍵基因。
結(jié)果表明,敲除mpdi的畢赤酵母菌株在表達外源淀粉樣蛋白α-syn時,其胞內(nèi)表達量低于野生型畢赤酵母表達α-syn,胞外沒有檢測到α-syn的表達。c c的表達量獲得了同樣的結(jié)果。通過三種淀粉樣蛋白在pdi正常表達與過表達菌株中的兩兩對比,分別篩選到了146、468、368個差異表達基因,其中分別有157、315、303個差異基因注釋到kegg生物通路。在細胞中,如果蛋白質(zhì)出現(xiàn)了錯誤折疊的現(xiàn)象,導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,不能形成其天然構(gòu)象時就會啟動應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)降解途徑來幫助這些蛋白質(zhì)降解。
其中,泛素-蛋白酶體降解途徑發(fā)揮著重要作用。因此在篩選差異基因時,我們著重關(guān)注了參與泛素化途徑的基因。在wt vs pdi-wt組中,沒有找到參與泛素化降解的基因,而在i66q vs pdi-i66q組中,發(fā)現(xiàn)gene3818參與了泛素化降解,在δw vs pdi-δw組中,發(fā)現(xiàn)gene3818,gene4516都參與了泛素化降解。綜上,敲除mpdi能夠降低外源淀粉樣蛋白α-syn和c c的表達量的結(jié)果暗示著mpdi協(xié)同pdi發(fā)揮分子伴侶的功能。在對關(guān)鍵基因的篩選中,認為雖然i66q是淀粉樣蛋白突變體,但是只發(fā)生了一個氨基酸的變化,與野生型雞胱抑素c相比較,它的構(gòu)象變化相對較小,所以只調(diào)動gene3818進行了蛋白質(zhì)的降解。而對于δw,由于該截短型突變蛋白缺失了一個α-helix2結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)變化相對較大,所以調(diào)動了gene3818、gene4516兩個基因?qū)﹀e誤折疊蛋白進行降解。
實驗篩選出的蛋白質(zhì)降解基因可為后期深入了解其對淀粉樣蛋白及錯誤折疊蛋白的降解提供線索,從而為淀粉樣蛋白疾病的治療提供潛在的分子伴侶藥物新靶點。