常見(jiàn)的用途分光光度計(jì)是一類(lèi)很重要的分析儀器,無(wú)論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門(mén),紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)督有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。
超微量分光光度計(jì)已成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。[1]
核酸的定量
核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈dna，以及rna。核酸的高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類(lèi)型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1od的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsdna，37μg/ml的ssdna，40μg/ml的rna，30μg/ml的olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如德國(guó)伯赫colibri超微量分光光度計(jì)的準(zhǔn)確度≤1.0%（1a）。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的ph值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用ph值一定、離子濃度較低的緩沖液，如te，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1a，吸光值好在0.1-1.。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高（超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍）。后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如a260/a280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8（dna）或者2.0（rna）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。a230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，*等，較純凈的核酸a260/a230的比值大于2.0。a320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，a320一般是0。
蛋白質(zhì)直接定量
這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開(kāi)”。與測(cè)試核酸類(lèi)似，要求a280的吸光值至少大于0.1a，線(xiàn)性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗(yàn)中選擇warburg公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察a280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閣arburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如dna的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如*，*）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有bca，bradford，lowry等幾種方法。
lowry法：以早期的biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與cu2反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與biuret相比，lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含edta，tritonx-100，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
bca（bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與cu2反應(yīng)產(chǎn)生cu，后者與bca形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其特點(diǎn)是，敏感度好，是lowry和bca兩種測(cè)試方法的2倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果；而且與一系列干擾lowry，bca反應(yīng)的還原劑（如dtt，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如：keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果lowry，bca測(cè)出的濃度明顯高于bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。如用lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以bsa作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液ph值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
od600
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生*，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。od600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的od值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。