中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
sn/t 4139-2015
出口水果蔬菜中乙萘酚殘留量的測(cè)定
determination of 2-naphthol residue in fruits and vegetables for export
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物源性食品中乙萘酚含量的高效液相色譜（hplc）檢測(cè)以及高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（lc-ms/ms）檢測(cè)和確證方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果、柑橘、小白菜、西紅柿等食品中乙萘酚含量的測(cè)定和確證。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可（ke）少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
3原理
試樣經(jīng)乙腈提取，氨基柱凈化，經(jīng)高效液相色譜儀和高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。
4試劑和材料
除特殊注明外，所有試劑均為分析純，水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
4.1乙腈：高效液相色譜級(jí)。
4.2甲醇：高效液相色譜級(jí)。
4.3甲苯。
4.4氯化鈉。
4.5乙腈-甲苯溶液（3+1，體積比）：量取300 ml乙腈（4.1）和100 ml甲苯（4.3），混勻后備用。
4.6乙腈溶液（5+5，體積比）：準(zhǔn)確量取50 ml乙腈（4.1）和50 ml水，混勻后備用。
4.7乙腈溶液（1 +9，體積比）：準(zhǔn)確量取10 ml乙腈（4.1）和90 ml水，混勻后備用。
4.8乙萘酚標(biāo)準(zhǔn)品：cas no.：135-19-3，純度≥99.5%。
4.9標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制溶液濃度1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20℃下保存。
4.10標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：用甲醇分別稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至終濃度約為10 mg/l，低于4℃下保存。
4.11基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.10），用空白樣品提取液配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
4.12氨基柱：3 ml，500 mg或相當(dāng)者。使用前用5 ml甲苯、5 ml乙腈和5 ml乙腈-甲苯溶液（4.5）活化。
4.13 0.22μm微孔濾膜，有機(jī)系。
5儀器和設(shè)備
5.1高效液相色譜儀，配有熒光檢測(cè)器。
5.2高效液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（esi）。
5.3電子天平：感量為0.01 g和0.01 mg。
5.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
5.5旋渦混勻器。
5.6氮吹儀。
5.7離心機(jī)：5 000 r/min。
5.8具塞塑料離心管：50ml。
6試樣制備與保存
6.1試樣制備
蔬菜、水果樣品取可食部分切碎，用均質(zhì)器勻漿后裝入潔凈容器內(nèi)密封，并標(biāo)明標(biāo)記。
6.2試樣的保存
將試樣于-18℃以下保存。
7測(cè)定步驟
7.1提取
稱取勻漿后的樣品10.0g于50 ml離心管中，加入25 ml乙腈（4.1），再加入3 g氯化鈉（4.4），渦旋振蕩提取5min，5000r/min離心3min將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中。用25ml（4.1）乙腈重復(fù)提取1次，合并有機(jī)相，在40℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)濃縮至約1 ml，向旋蒸瓶中加入5ml乙腈-甲苯（3+ 1）（4.5）溶液溶解殘?jiān)?，待凈化?br>7.2凈化
將上述溶液全部轉(zhuǎn)移至活化后的氨基柱上，用雞心瓶收集流出液，再每次用2 ml乙腈-甲苯（3+1）（4.5）溶液洗滌旋蒸瓶3次，并將洗滌液移入柱上，再用10 ml乙腈甲苯（3+ 1）（4.5）溶液洗脫化合物，收集全部流出液。并在40℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)濃縮至約1 ml，氮吹至干。hplc法用1 ml乙腈溶液（4.6）或lc-ms/ms法用1 ml乙腈溶液（4.7）溶解殘?jiān)?，過(guò)濾膜后供hplc或lc-ms/ms測(cè)定。
7.3測(cè)定
7.3.1液相色譜條件
液相色譜條件如下：
a）色譜柱：c18柱，250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑），5.0μm，或功能相當(dāng)者；
b）流動(dòng)相：乙腈和水（50+50，體積比），等體積洗脫；
c）流速：1 ml/min；
d）波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)λex=250 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=410 nm；
e）柱溫：30℃；
f）進(jìn)樣量：20μl。
7.3.2液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件
液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件如下：
a）色譜柱：c18，150 mm×2.0（i.d.）mm，5.0μm，或功能相當(dāng)者；
b）流動(dòng)相：乙腈（b）：2 mmol/l乙酸銨溶液（a），梯度洗脫程序見(jiàn)表1；
c）流速：0.30 ml/min或根據(jù)儀器條件優(yōu)化；
d）柱溫：40℃；
e）進(jìn)樣量：30μl；
f）離子源：電噴霧離子源；
g）離子化模式：負(fù)離子；
h）掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（mrm）；.
i）其他質(zhì)譜條件：見(jiàn)附錄a。
7.3.3定量測(cè)定
高效液相色譜法采用保留時(shí)間定性、峰面積定量，如果殘留量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)用定容溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見(jiàn)附錄b中的圖b.1，乙萘酚的保留時(shí)間為8.0 min。
液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件測(cè)定樣液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作容液，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣液中的乙萘酚藥物殘留量。樣品中待測(cè)物殘留量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，如果殘留量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)用空白樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)附錄b中的圖b.2，乙萘酚的保留時(shí)間為9.1min。
7.3.4定性測(cè)定
按照上述條件測(cè)定樣液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣液中待測(cè)物的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，并且在扣除背景后的樣液譜圖中，所選擇的離子對(duì)均出現(xiàn)，各定性離子的相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)品離子的相對(duì)豐度相比，相對(duì)豐度偏差不超過(guò)表2的規(guī)定，則可判斷樣品中存在相應(yīng)的被測(cè)物。
7.3.5空白實(shí)驗(yàn)
除不加試樣外，均按上述測(cè)定步驟進(jìn)行。
8結(jié)果計(jì)算
用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按照式（1）計(jì)算樣品中待測(cè)物的殘留量，計(jì)算結(jié)果需扣除空白。
式中：
x——試樣中被測(cè)組分含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
c——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的被測(cè)組分溶液濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v——試樣溶液定容體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣溶液所代表的質(zhì)量，單位為克（g）。
9測(cè)定低限、回收率
9.1測(cè)定低限
高效液相色譜的測(cè)定低限為50μg/kg，高效液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜的測(cè)定低限為10μg/kg。
9.2回收率
不同基質(zhì)中添加深度水平下的回收率范圍見(jiàn)表3和表4。