1.原理等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點進(jìn)行分離的技術(shù)，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性ph梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的ph梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的ph條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點位置時，其靜電荷數(shù)為零，在電場中不再移動，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時，才能獲得較好的蛋白質(zhì)條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統(tǒng)（否則會導(dǎo)致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時比較多種蛋白質(zhì)樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。由于等電聚焦對蛋白質(zhì)的電荷差異非常敏感，若要好的重復(fù)性，制備蛋白樣品時一定要小心，要避免任何對蛋白質(zhì)化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的修飾。另外，蛋白質(zhì)－脂類、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用可引起電荷改變，進(jìn)而導(dǎo)致等電點遷移或紋理現(xiàn)象。除非特殊需要研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用或者必須保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統(tǒng)中進(jìn)行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。2.主要儀器、試劑儀器：微型電泳系統(tǒng)、電源、注射器、固定和染色用容器 試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質(zhì)、尿素、過硫酸胺、temed、tritonx－100、2－巰基乙醇、溴酚藍(lán)、磷酸、氫氧化鈉、、三***、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、乙酸。 儲存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%triton x100；3）10%三***；4）1%三***；5）1%溴酚藍(lán)；6）考馬斯亮藍(lán)染色液；7）考馬斯亮藍(lán)脫色液；3.載體兩性電解質(zhì)的選擇載體兩性電解質(zhì)是一些具有相近等電點的分子量為600－900da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時配置不同ph范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質(zhì)的配方：4.灌膠以灌制8cm×7cm×0.75mm ph4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他ph范圍等電聚焦可以參考表格來配置。水：5.4ml； 儲存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質(zhì)溶液ph3.5-10 48μl； 載體兩性電解質(zhì)溶液ph4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過硫酸胺25μl； temed：20μl灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質(zhì)溶液混勻，避免劇烈搖動，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過硫酸胺和temed，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產(chǎn)生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內(nèi)（不要產(chǎn)生氣泡）；6）聚合約1小時；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前好用陽極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過程中會發(fā)生聚合；2）現(xiàn)在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統(tǒng)（如pharmmacia－lkb,hoefer）.樣品制備和上樣： 一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數(shù)目會有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔大上樣量大約15μl。變性凝膠上樣緩沖液2×buffer（適用于ph4-6）：1）尿素：2.4g；2）ph3.5-10載體兩性電解質(zhì)：20μl；3）ph4-6載體兩性電解質(zhì)：100μl；4）20%triton x－100：500μl：5）2－巰基乙醇：50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍(lán)：200μl5.電泳操作步驟：1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質(zhì)沉淀；2）用微量注射器將蛋白質(zhì)樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來。注意：對于考馬斯亮藍(lán)染色液來說，每個泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。電泳液：1）上槽中加入陰極電泳液（20mm氫氧化鈉：須由1m儲存液新鮮配置）；2）下槽中加入陽極電泳液（10mm磷酸：須由1m儲存液新鮮配置）。等電聚焦電泳條件：1）接好電極；2）恒壓150v電泳30min；3）恒壓200v電泳2.5h，開始時候控制電流為10ma左右，在聚焦過程中電流有所下降，電泳內(nèi)室溫度在電泳的過程中將升至40－50攝氏度。6．電泳聚焦后處理測定ph梯度：1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；2）將每小片凝膠在1ml 10mm kcl中 浸泡30min；3）測讀此kcl溶液的ph值、凝膠的固定：1）將凝膠于10%三***中浸泡10min；2）換成1%三***溶液繼續(xù)浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質(zhì)，浸泡過夜可以更好的降低考馬斯亮藍(lán)對載體兩性電解質(zhì)的染色。凝膠的染色：用考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色，制成干膠。7.天然等電聚焦電泳的修正方案如果要進(jìn)行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；1） 膠過程中配的凝膠中不需要加尿素；2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質(zhì)（同制膠成分），3ml甘油，上樣時候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200v電泳1.5h，再400v電泳1.5h。