當(dāng)有機(jī)或無機(jī)的活體或非活體標(biāo)本吸收并隨后再發(fā)光時，該過程被描述為光致發(fā)光。如果在激發(fā)能量（光）停止后光的發(fā)射持續(xù)長達(dá)幾秒鐘，則該現(xiàn)象被稱為磷光。另一方面，熒光描述了僅在吸收激發(fā)光期間持續(xù)的光發(fā)射。激發(fā)光的吸收與熒光再發(fā)射光之間的時間間隔非常短，通常小于百萬分之一秒。
熒光現(xiàn)象在十九世紀(jì)中葉就已知了。英國科學(xué)家喬治·斯托克斯爵士（sir george g. stokes）首先提出了這樣一個觀察：礦物螢石在被紫外光照射時表現(xiàn)出熒光，他創(chuàng)造了“熒光”這個詞。斯托克斯觀察到，熒光燈的波長比激發(fā)光的波長長，這種現(xiàn)象已經(jīng)成為斯托克斯位移。在圖1中，一個紫外線（紫色）的光子與一個簡單原子中的電子碰撞，激發(fā)和提升電子到更高的能級。隨后，激發(fā)的電子松弛到較低的水平，并在可見光區(qū)域以較低能量的光子（紅色）的形式發(fā)光。圖2是電磁輻射的可見光區(qū)域的示意圖，該電磁輻射涵蓋從約400至700納米的波長范圍。可見光區(qū)域周圍是較高能量的紫外光和較低能量的紅外光。
熒光顯微鏡是一種很好的研究材料的方法，可以以天然形式（稱為主要或自發(fā)熒光）或用能夠發(fā)熒光的化學(xué)物質(zhì)（稱為次要熒光）處理時發(fā)出熒光。熒光顯微鏡是由二十世紀(jì)早期的八月克勒，卡爾賴克特和海因里希萊曼等人設(shè)計的。然而，這種儀器的潛力幾十年來沒有實現(xiàn)，熒光顯微鏡現(xiàn)在是細(xì)胞生物學(xué)中一個重要的（也許是*的）工具。
早期的調(diào)查顯示，許多標(biāo)本，包括微量礦物質(zhì)，晶體，樹脂，生藥，黃油，葉綠素，維生素和無機(jī)化合物，表現(xiàn)出紫外線照射自體熒光。然而，直到20世紀(jì)30年代，奧地利研究人員max haitinger和其他科學(xué)家開發(fā)了二次熒光技術(shù)，該技術(shù)使用熒光染料標(biāo)記特定的組織成分，細(xì)菌和其他不自發(fā)熒光的病原體。這些熒光染料標(biāo)記到特定的生物化學(xué)目標(biāo)，激發(fā)了熒光顯微鏡的使用。在二十世紀(jì)五十年代，當(dāng)albert coons和nathan kaplan證明抗原在與熒光素標(biāo)記的抗體反應(yīng)的組織中定位時，儀器的值顯著增加。
熒光顯微鏡的基本任務(wù)是允許激發(fā)光照射樣品，然后從較亮的激發(fā)光中分離較弱的發(fā)射熒光。因此，只有來自標(biāo)本的發(fā)射光到達(dá)眼睛或其他檢測器（通常是數(shù)字或傳統(tǒng)膠片相機(jī)）。所產(chǎn)生的熒光區(qū)域在黑暗背景下明亮地照射，具有足夠的對比度以允許檢測。無熒光材料背后的背景越黑暗，儀器的效率越高。
圖3表示熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)本時的發(fā)生情況。紫外線（uv）通過使來自紫外發(fā)射源的光通過激勵濾波器而產(chǎn)生特定波長或波長組。被過濾的紫外光照射樣品，在這種情況下是螢石晶體，當(dāng)紫外光照射時，螢石發(fā)射熒光。從樣品發(fā)出的可見光（圖3中的紅色）然后通過不允許反射的紫外光通過的屏障過濾器進(jìn)行過濾。應(yīng)該指出，這是顯微鏡的模式，其中樣品在激發(fā)之后產(chǎn)生自己的光。無論激發(fā)光的方向如何，發(fā)射的光線都會在所有方向上（360度角）重新發(fā)射。
熒光顯微鏡是一個迅速擴(kuò)大和無價的調(diào)查工具。其優(yōu)點是基于其他光學(xué)顯微鏡技術(shù)中不易獲得的屬性。熒光染料的使用使得有可能在非熒光物質(zhì)中以高度特異性鑒別細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞組分和其他實體。更重要的是，熒光顯微鏡可以揭示熒光物質(zhì)的存在，并具有*的靈敏度。可以檢測極少量的熒光分子（每立方厘米少至50個分子）。在給定的樣品中，通過使用多重染色，不同的探針將揭示個別靶分子的存在。
熒光顯微鏡技術(shù)可應(yīng)用于有機(jī)材料，以前的生物（生物）材料，或活體材料（使用體外或體內(nèi)熒光染料）或無機(jī)材料（特別是在調(diào)查半導(dǎo)體晶圓上的污染物） 。還有一些研究使用熒光探針來監(jiān)測快速變化的生理離子濃度，如鈣和鎂，以及活細(xì)胞中的ph值。
許多植物和動物組織以及材料樣本在用較短波長的光照射時（初級或自發(fā)熒光）固有地發(fā)熒光。自發(fā)熒光在植物研究，煤巖學(xué)，沉積巖石巖石學(xué)和半導(dǎo)體工業(yè)中被發(fā)現(xiàn)有用。在動物組織或病原體的研究中，自發(fā)熒光常常是非常微弱的或者非特異性的，以使得自發(fā)熒光的小效用。對于這樣的標(biāo)本來說，更大的價值是通過照射光而激發(fā)的外在熒光染料（也稱為熒光團(tuán)），并且其發(fā)射光的終產(chǎn)量具有更大的強度。這種熒光稱為二次熒光。
熒光染料是有點類似于更為人所知的可見光吸收組織污漬，它們自身附著在可見或不可見的有機(jī)物上。這些能夠吸收并隨后再輻射光的熒光染料在其附著靶向中通常是高度特異的，并且在吸收 - 發(fā)射比（稱為量子產(chǎn)率的概念）方面具有顯著的產(chǎn)量。這使得熒光色素在生物應(yīng)用中非常有價值。熒光顯微鏡使用的增長與數(shù)百種具有激發(fā)（吸收）和發(fā)射的強度曲線以及廣為人知的生物結(jié)構(gòu)目標(biāo)的熒光染料的發(fā)展密切相關(guān)。
圖4所示是熒光顯微的兩種熒光染料。流行的核酸染色劑4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）（圖4中的左側(cè)分子）是以兩個高親核性脒基部分為特征的吲哚衍生物，其可用于熒光標(biāo)記核酸，在熒光分析中被廣泛應(yīng)用于病原體的快速鑒定。初作為潛在的抗錐蟲劑合成，dapi優(yōu)先結(jié)合腺苷和胸苷（at）堿基對區(qū)域，并被大吸收波長為355納米的紫外光激發(fā)。染料在可見光譜的藍(lán)色區(qū)域發(fā)出熒光。在dapi分子的右側(cè)（圖4）是另一種熒光染料德克薩斯紅，其熒光共軛物的性質(zhì)已被*研究。這種熒光染料被開發(fā)用于流式細(xì)胞儀應(yīng)用中的雙重標(biāo)記，但廣泛用于代替羅丹明（另一種常見熒光染料）用于熒光顯微鏡中的抗體檢測。
在許多情況下，德克薩斯紅與dapi和異硫氰酸熒光素（fitc）結(jié)合用于多染色的樣品，由于染料的紅色，藍(lán)色和綠色熒光可以觀察到。當(dāng)決定使用哪種標(biāo)記進(jìn)行熒光顯微鏡檢查時，必須牢記，所選擇的熒光染料應(yīng)該具有很高的吸收激發(fā)光的可能性，并且應(yīng)該保持與目標(biāo)分子連接。熒光染料還應(yīng)該能夠提供令人滿意的發(fā)射熒光的產(chǎn)量。
熒光顯微鏡重要的應(yīng)用之一是在免疫熒光領(lǐng)域?；铙w動物制造無數(shù)抗體，與白細(xì)胞一起使用，以中和任何進(jìn)入的含有或產(chǎn)生抗原的病毒，細(xì)菌和外來蛋白質(zhì)等異物?？乖贵w反應(yīng)是高度特異性的，通常被比喻為鎖定和關(guān)鍵的關(guān)系。免疫熒光的成功在于熒光顯微鏡的靈敏度和免疫學(xué)所表現(xiàn)的高度特異性之間的聯(lián)系。
在直接免疫熒光中，特異性抗體通過化學(xué)附著熒光物質(zhì)以形成所謂的綴合物來標(biāo)記，然后將其涂布在含有已知刺激抗體產(chǎn)生的特定抗原的疑似存在的顯微鏡載玻片上。如果存在抗原，那么標(biāo)記的抗體綴合物結(jié)合抗原并在洗滌之后保持與樣本結(jié)合。當(dāng)熒光染料在其激發(fā)峰處被激發(fā)時，化學(xué)連接的熒光綴合物和抗原的存在被證實，然后可以目視觀察或者由檢測器系統(tǒng)（數(shù)字或傳統(tǒng)照相機(jī)）捕獲隨后的各種波長的發(fā)射強度。
另一種常用的技術(shù)被稱為間接技術(shù)免疫熒光，其中可能含有未標(biāo)記的抗體及其相關(guān)但已知的抗原的血清一起溫育。然后將與抗人抗體綴合的熒光物質(zhì)（如果被測試的樣品是人的）置于含有未標(biāo)記的抗體 - 抗原的載玻片上。如果確實存在抗原 - 抗體反應(yīng)，則熒光染料標(biāo)記的抗人抗體自身附著到由抗原和抗體形成的復(fù)合物上。隨后，針對該熒光染料的峰值波長強度激發(fā)抗原，抗體和熒光染料標(biāo)記的抗人抗體的標(biāo)記分組，并且觀察到任何產(chǎn)生的發(fā)射。間接免疫熒光技術(shù)降低了庫存大量標(biāo)記抗體的必要性，并且通常也導(dǎo)致更大的熒光強度。
熒光研究的一個重要領(lǐng)域涉及細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)染色。熒光染料已被用于鑒定染色體，dna含量，蛋白質(zhì)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，激素和維生素。熒光顯微鏡是一個強大的工具，在這樣的研究中，由于精選的熒光染料的敏感性及其對樣品中極微量的特異性。實際上，盡管熒光顯微鏡的空間分辨率受到數(shù)值孔徑和衍射極限所控制的通常規(guī)則的限制，但熒光探針可以通過發(fā)射的光通過使這種材料即使在僅存在于子區(qū)域中時也可見而顯示熒光材料的存在，分辨率量（如幾個分子）。
熒光顯微鏡的新興應(yīng)用包括將熒光探針（熒光染料）應(yīng)用于活體材料，體外（玻璃）和體內(nèi)（生活）。由于可能的毒性限制，這些探針的困難倍增。另外，由于生命過程的不斷變化和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的運動，必須對時間間隔進(jìn)行相當(dāng)大的關(guān)注。熒光研究已應(yīng)用于重要生物離子如氫（ph），鈣和鎂離子濃度的改變，結(jié)合和未結(jié)合。
其中著名的是使用流行的熒光探針fura-2對細(xì)胞內(nèi)鈣的研究。對于這種染料，可以在單個發(fā)射波長處監(jiān)測大約340和380納米（使用光斬波器和雙激發(fā)濾波器或單色器）的雙激發(fā)，其針對每個激發(fā)帶獨立測量?？刂骑@微鏡的主計算機(jī)用于計算比率（在稱為比例成像的過程中）熒光）結(jié)合到游離的細(xì)胞內(nèi)鈣，如通過熒光發(fā)射強度的變化所揭示的。比例法的優(yōu)點在于，除了雙近紫外激發(fā)波長之外，基本上所有的因素都保持不變，每個波長都在可見光譜的綠色部分產(chǎn)生發(fā)射。使用稱為indo-1的探針進(jìn)行類似類型的比率成像。對于這種也用于測定細(xì)胞內(nèi)結(jié)合和非結(jié)合鈣的熒光染料，使用單一激發(fā)波長，但是在兩個波長的每一個波長處測量發(fā)射以區(qū)分結(jié)合的鈣和未結(jié)合的鈣。