常見的pcr反應(yīng)抑制物一覽
一個pcr反應(yīng)過程分為很多的步驟，同時也受到很多因素的影響，可以分為內(nèi)部因素和外部因素，內(nèi)部因素是指正常試劑體系中的成分，外部因素是指環(huán)境或者樣本帶入的因素。
體系內(nèi)部因素
引物：引物是整個pcr體系最重要的部分，也是決定一個pcr反應(yīng)特異性的關(guān)鍵，引物在設(shè)計時要遵守一定的原則（長度、擴增跨度、堿基等）。
酶及其濃度：目前有兩種taq dna聚合酶，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸桿菌合成的基因工程酶，酶濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
dntp的質(zhì)量與濃度：dntp溶液呈酸性，一般配置成體系需將其調(diào)節(jié)至7.0-7.5，正常情況下4種dntp的濃度應(yīng)該相等，如果其中某一種過高就會引起錯配，濃度過低又會引起pcr產(chǎn)物的產(chǎn)量。
模板核酸（靶標）：模板核酸的量和純化程度，是pcr成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，對于rna模板更要注意rna的降解。
mg2+濃度：主要影響pcr擴增的特異性和產(chǎn)量，一般要對應(yīng)dntp的濃度。mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴增，濃度過低會降低taq dna聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
溫度與時間的設(shè)置：pcr原理三步驟涉及變性-退火-延伸三個溫度點，也就是變性溫度與時間、退火（復(fù)性）溫度與時間、延伸溫度與時間。
循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定pcr擴增程度，pcr循環(huán)次數(shù)主要取決于模板dna的濃度。一般溫度循環(huán)次數(shù)在30-40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量就越多。
其他抑制劑
除上述抑制劑外，還存在一定的pcr增強劑，比如甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、peg、亞精胺和單鏈dna結(jié)合蛋白等，但是在高濃度情況下，也會對pcr產(chǎn)生抑制，因此如何采用增強劑消除抑制劑的影響，采用多少的濃度對結(jié)果都存在很大的影響。
臨床pcr常見問題
1假陽性問題
方法學(xué)問題：靶基因序列特異性、引物錯配、非特異性擴增
污染問題：樣本污染、產(chǎn)物污染、產(chǎn)物污染
解決辦法：嚴格區(qū)分試驗區(qū)域及人員培訓(xùn)，使用ung技術(shù)
2假陰性問題
問題來源：試劑因素、操作因素、儀器因素、標本因素
解決辦法：
設(shè)置陽性對照監(jiān)測試劑問題
降低操作難度，提高操作人員水平
室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)控監(jiān)控
使用抗干擾能力強的試劑提取樣本