聚合物膠束（polymeric micelles，pms）作為載體在靶向治療領域具有廣泛的應用。納米級聚合物膠 束（簡稱聚合物納米膠束）作為載體能夠通過被動靶 向、主動靶向及物理化學敏感等方式遞送藥物至靶 位并控制釋藥，用于各類疾病的診斷和治療。
1 材料與方法
1． 1 細胞
肝癌細胞 snu-423 由山西醫(yī)科大學山 西省重點實驗室傳代培養(yǎng)。
1． 2 主 要 試 劑 及 儀 器
rpmi medium modified、 dmem ／ high glucose 購自美國 hyclone 公司； 胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司； dmpe-peg-maleimide、dppe-peg-maleimide、dspepeg-maleimide、dope-peg-maleimide、dlpe-pegmaleimide 購自美國阿拉丁工業(yè)公司；fitc 標記的 goat anti-rabbit igg hl、anti-golph2 antibody 購 自英國 abcam 公司；vortex-5 漩渦混合器購自海 門市其林貝爾儀器制造有限公司；up-250 超聲波細 胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司； fcm 購自美國 bd 公司。
1． 3 空載聚合物納米膠束的制備
分別精確稱取10． 00 mg 的 dmpe-peg-maleimide、dppe-peg-maleimide、dspe-peg-maleimide、dope-peg-maleimide 及 dlpe-peg-maleimide，置于 5 ml 離心管中，逐滴 加入 2 ml 無菌的 pbs 溶液，置漩渦混合器上充分 渦旋溶解，靜置 5 min；超聲 3 次，每次 10 s，靜置 5 min；經(jīng) 0． 22 μm 濾膜過濾，獲得 5 種試劑的空載 聚合物納米膠束。
1． 4 空載聚合物納米膠束與 anti-golph2 抗體偶聯(lián)
無菌環(huán)境下，取 5 ml 離心管，分別加入 5 種空載聚合 物納米膠束，每管中加入 0． 647 mg ／ ml anti-golph2 抗體，使抗體終濃度分別為 2． 5、5． 0、7． 5 μg ／ ml， 置25 ℃，120 r ／ min 搖床孵育 12 h。
1． 5 snu-423 細胞膜表面 golph2 抗原表達量的檢測
1． 5． 1 細胞分組
取對數(shù)生長期的 snu-423 細胞， 均勻接種于 6 孔板，待細胞長至 80％ ～ 90％時，消化 收集細胞，移入 5 ml 的無菌離心管中，335 × g 離心 5 min；用 2 ml pbs 洗滌 2 次，調(diào)整離心管中細胞的 濃度為 1 × 106 個 ／ ml。將細胞分為對照組及實驗 組，對照組為 goat anti-rabbit igg hl 孵育過的細 胞；實驗組為經(jīng) anti-golph2 抗體標記 goat antirabbit igg hl 孵育過的細胞。
1． 5． 2 孵育
anti-golph2 抗體 將 anti-golph2 抗體用 pbs 按 1 ∶ 1 000 稀釋。僅將實驗組 snu-423 細胞離心，棄上清，收集細胞沉淀，每個離心管中分 別加入 0、2． 5、5． 0 和 7． 5 μg ／ ml anti-golph2 抗 體，重懸細胞，混勻，室溫下避光孵育 2 h；335 × g 離 心 5 min；回收含 anti-golph2 抗體的上清液，細胞 沉淀用 pbs 洗滌 2 次，335 × g 離心 5 min，收集細 胞沉淀。
1． 5． 3 孵育
fitc 標記的 goat anti-rabbit igg hl 對照組及實驗組細胞沉淀中分別加入 goat antirabbit igg hl（1 ∶ 500 稀釋），室溫避光孵育 30 min； 335 × g 離心 5 min；收集上清，留存細胞沉淀用 pbs 洗滌 2 次，再用適量 pbs 重懸。采用 fcm 檢測對照 組及實驗組 snu-423 細胞中異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，fitc）熒光強度。
1． 6 snu-423 細胞與偶聯(lián)有
anti-golph2 抗體的 空載聚合物納米膠束共同孵育 用 6 孔 板 培 養(yǎng) snu-423 細胞，每孔細胞增殖至 80％時，用 0． 25％ *消化，335 × g 離心 5 min，收集細胞，pbs 洗滌 2 次。將 anti-golph2 抗體用無血清培養(yǎng)基按 1 ∶ 1 000 稀釋，取適量抗體稀釋液重懸細胞沉淀，置 25 ℃，120 r ／ min 搖床孵育 2 h；335 × g 離心 5 min； 收集上清；留存細胞沉淀經(jīng) pbs 洗滌 2 次，用 3 mlpbs 重懸細胞，335 × g 離心 5 min；棄上清，加入偶 聯(lián)有 anti-golph2 抗體的空載聚合物納米膠束培養(yǎng) 液混懸，置 25 ℃，120 r ／ min 搖床孵育 6 h。
2 結(jié) 果
snu-423 細胞膜表面的 golph2 抗原相對表達量 ［實驗組（6． 96％）與對照組（5． 73％）的差值］為 1． 23％。與對照組相比，實驗組細胞膜表面 golph2 陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（f ＝ 6． 91，p ＞ 0． 05）。 見圖 1 和圖 2。
各類聚合物納米 膠束經(jīng)不同濃度的 antigolph2 孵育后，其 fitc 熒光強度與 anti-golph2 濃度呈正相關；在相同的 anti-golph2 濃度下，各 類聚合物納 米 膠 束 與 anti-golph2 的 偶 聯(lián) 效 率 存 在 明 顯 的 差 異。其 中 dlpe-peg-maleimide 與 dppe-peg-maleimide、dmpe-peg-maleimide、dspepeg-maleimide，差異有統(tǒng)計學意義（f ＝ 6． 72，p ＜ 0． 05）。
3 討 論
聚合物納米膠束作為兩親性材料，在水相中能 自組裝成核-殼式結(jié)構(gòu)，即疏水性內(nèi)核和親水性外殼 組成。其中疏水性內(nèi)核能夠包載難溶性的藥物，以 提高其穩(wěn)定性和生物利用度。而親水性外殼則 影響著聚合物納米膠束在體內(nèi)的穩(wěn)定性、循環(huán)動力 學及體內(nèi)積累等表征。聚乙二醇（polyethylene glycol，peg）具有無毒、水溶性好、靈活性高等特性， 被廣泛地用于聚合物納米膠束的親水段。 在主動靶向載體合成的過程中，可先將配體與 含 peg 的聚合物納米材料進行偶聯(lián)，再連接于其他 類細胞膜的載體上。本研究將 anti-golph2 antibody 與含 peg 的聚合物納米膠束共同孵育，使其彼 此偶聯(lián)，再使其與 snu-423 細胞膜進行耦合，通過 fitc 標記抗體特異性的結(jié)合 anti-golph2 antibody， 應用 fcm 可較為靈敏地捕獲微量的抗體與 fitc 結(jié) 合所發(fā)出的熒光。
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