實時熒光定量pcr（quantitative real-time pcr）簡稱qpcr，是一種在dna擴增體系中加入熒光基團，通過聚合酶鏈式反應（pcr）循環(huán)實現(xiàn)熒光信號的積累，從而實現(xiàn)檢測每次pcr循環(huán)后產(chǎn)物總量的一種方法，是核酸檢測和定量分析的“金標準”。
技術原理
實時熒光定量pcr根據(jù)所使用的熒光標記方法可分為兩種：熒光染料（sybr green i染料為主）和熒光探針（taqman探針）。
①sybr green i染料法
sybr green i染料是一種結合于所有雙鏈dna雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。這種染料在反應體系中處于游離狀態(tài)時，發(fā)出的熒光極其微弱，但當其與dna雙鏈結合的時候，熒光信號就會被放大，從而被儀器所檢測。在pcr實驗中，染料的結合量與dna的濃度呈現(xiàn)正比關系，所以我們可以通過檢測熒光信號的強度來反映pcr體系中dna的濃度。
優(yōu)點：可用于檢測任何雙鏈dna序列的擴增，無需單獨設計探針，操作簡單，成本較低。
②taqman探針法
taqman熒光探針是進行熒光檢測的另一種方法。taqman熒光探針是由5’端的熒光報告基團、3‘端的熒光淬滅基團和靶基因特異性結合的序列構成。當探針在反應體系中處于游離狀態(tài)時，熒光報告基團的信號會被熒光淬滅基團所吸收。但當pcr進行到退火、延伸階段時，dna聚合酶會將熒光報告基團和熒光淬滅基團分離，從而發(fā)出熒光，因此探針法也可以通過檢測熒光信號強度來反應pcr體系中dna的濃度。
優(yōu)點：熒光探針只與目的序列結合，具有良好的特異性，無需實驗優(yōu)化；不同波長的熒光報告基團可以標記不同的探針，兼容多重反應。
常見術語：
ct值：c代表cycle，t代表threshold，即指qpcr在擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環(huán)數(shù)。
惰性參比染料（rox）：用作熒光信號標準化內(nèi)部參照，可以逐孔校正因移液不準確、孔位置及熒光波動造成的變動。
擴增曲線：amplification curve ，隨著pcr反應的進行，熒光信號強度隨著擴增產(chǎn)物的增加逐漸增強，通過熒光強度來檢測擴增產(chǎn)物的變化。
擴增效率：一個dna分子擴增為2個dna分子，這種情況下的擴增效率為100。實際上會出現(xiàn)偏高和偏低的情況，90-110%之間。
溶解曲線：melting curve，是指擴增反應結束后，對雙鏈dna進行升溫處理，此時，dna雙鏈逐漸解開，染料脫落，熒光值下降，熒光值隨溫度變化的曲線即“溶解曲線”，可用來判斷體系中是否含有引物二聚體和非特異性擴增。
ntc：無模板對照（no template control），是指擴增反應中，模板通常用水來代替，用于檢測試劑污染或外源dna造成的污染。
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