es細胞培養(yǎng)
原代胚胎成纖維細胞（me）的制備
1.取12.5-13.5dpc孕鼠，斷頸處死；
2.將鼠腹面向上放置，70%酒精潤濕、消毒腹部（防止腹毛飛揚，污染內(nèi)臟及子宮），剪開皮膚層、肌肉層，打開腹腔，將連接在子宮上的結(jié)締組織及脂肪剪去，將子宮取出，轉(zhuǎn)入無菌10cm平皿中；
3.把平皿轉(zhuǎn)入超凈臺；
4.用鑷子打開子宮壁，擠出鼠胚，并與胚外組織、胎盤等分離，除去鼠胚的頭、四肢及各種內(nèi)臟（主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等）；
5.將鼠胚移入另一新的無菌皿，用pbs洗三次；
6.棄去pbs，用彎頭剪將鼠胚剪碎，加入pbs洗至溶液基本無色（1－4次）；
7.加入適量trypsin-edta（0.25%gibco25520，下同），體積約等于組織塊體積；
8.用滴管輕輕吹勻，室溫下消化1－10分鐘（或消化至溶液渾濁變粘），加入與消化液等體積培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻（5－10次），靜置；
9.沉降后將上部溶液輕輕吸出，轉(zhuǎn)入離心管中。
10.將細胞懸液管離心（1000轉(zhuǎn)5分鐘）；
11.棄去上清，向沉淀中加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸，將其分種至10cm細胞培養(yǎng)皿，補加適量培養(yǎng)基，作標簽（me－0；注意：若凍存，則可以使用復(fù)蘇后的0代me制作feeder；若直接使用則不用0代me細胞做feeder，要傳到一代以后再用來制作feeder比較好），轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
12.視細胞生長情況換液（一般3天換液一次），若細胞已長滿，則凍存，或者1：3-5傳代（視細胞疏密而定），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（此后不用再換液）；1－5代的me細胞均可用來制作feeder。
飼養(yǎng)層細胞（feeder）的制備
注：含10ug/mlc的dmem血清培養(yǎng)基（fbs占10%）（實驗室所用mmc為10mg/ml，calbiochem）
1.棄去細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入適量含10ug/mlc的培養(yǎng)基（dmem+10%fbs）；
2.放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3小時（2－4小時）；
3.用0.1%明膠處理培養(yǎng)皿（將明膠加入，搖動使明膠覆蓋全部皿底，然后吸出明膠棄去即可），室溫放置2小時以上，至皿底明膠干燥為止；
4.棄去含有c的培養(yǎng)基，加入2－3mlpbs，輕輕搖動，棄去pbs，如此洗3-5次（必須洗3次以上，以便洗去殘存的，是有絲分裂抑制劑，因而對es細胞有毒性）；
5.加入適量消化30秒，吸去消化液，靜置至細胞層出現(xiàn)裂縫或明顯滑壁為止，加入培養(yǎng)基，吹打，種至明膠處理過的培養(yǎng)皿中即可（如細胞過稀，可再補加處理過的細胞），半小時后即可使用（如果急用，則可以用es細胞培養(yǎng)基終止消化，然后與es細胞一起轉(zhuǎn)入明膠處理過的新板上），可使用6－10天，用前更換培養(yǎng)液（如未用明膠處理培養(yǎng)皿，則需在培養(yǎng)箱中放置2小時以上方可使用；是前一天下午制作feeder，第二天上午使用，這時的feeder狀態(tài)，es細胞貼壁生長，而且萬一制作的feeder在第二天早上發(fā)現(xiàn)出了問題，還可以趕緊補做）。
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