自從篇介紹原位雜交作為檢測和研究染色體和細胞中dna序列的方法的研究論文發(fā)表以來，已經過去了近25年。然而，在過去的15年中，通過發(fā)展熒光技術使光學顯微鏡發(fā)生了突破，該技術允許以的簡便性，精確度和準確性來定位，識別和記錄生物醫(yī)學樣品的基因組成數(shù)據(jù)。
圖1-多色fish實驗
同時使用多種熒光色可以大大擴展原位雜交的能力。的多色熒光原位雜交（fish）可用于識別與雜交中使用的不同熒光團一樣多的標記特征。通過不僅使用單色，而且使用顏色的組合，可以使用數(shù)字成像顯微鏡在單個細胞中同時檢測更多標記的特征。
在呈現(xiàn)圖1是一個典型的多色fish標本。正常雄性淋巴細胞與fitc*標記的chr21和chry探針以及cy3洋地黃毒苷標記的chrl3和chry探針雜交。左上方是使用dapi濾鏡組拍攝的dapi染色的dna核圖像。右上方是使用fitc濾鏡組拍攝的用fitc染色的chr21和chry圖像。左下方是使用cy3濾鏡組拍攝的chrl3和chry染色的cy3圖像。右下方的圖像是合并的彩色合成圖像，顯示了所有目標染色體的顏色。標本由馬薩諸塞州弗雷明漢的整合遺傳學的蒂姆·豪斯爾博士提供。
如今，多色fish技術與數(shù)字成像技術相結合，為多種同位素序列的非同位素檢測提供了*的功能，可用于分析細胞成分，染色體和基因。
在整個生命科學中，熒光是一種在一種光波長下激發(fā)化學物質發(fā)出不同波長（通常更長）的光的現(xiàn)象，用于研究各種各樣的結構和細胞內活性。在過去的十年中，探針和顯微鏡技術的進步導致熒光技術的飛速發(fā)展。
這篇評論文章將介紹fish技術的基礎知識。研究人員多年來在使用fish方面面臨的局限性；影響該技術發(fā)展的硬件，軟件，探針和試劑的發(fā)展；和該領域的發(fā)現(xiàn)。隨著該技術開始從單純的研究擴展到臨床診斷環(huán)境，fish的新發(fā)展也將得到審查。
fish技術概述fish在基因組學，細胞遺傳學，產前研究，腫瘤生物學，放射標記，基因作圖，基因擴增和基礎生物醫(yī)學研究中正在迅速增長。原則上，該技術非常簡單。
雜交反應識別或標記了靶基因組序列，因此可以研究其位置和大小。首先用報告分子標記來自適當?shù)娜旧w特異性探針的dna或rna序列，然后通過熒光顯微鏡鑒定。然后將標記的dna或rna探針與載玻片上的中期染色體或相間核雜交。洗滌和信號放大后，通過熒光顯微鏡檢查樣本中的報告分子。
fish可以對形態(tài)和基因組結構進行非常精確的空間解析。該技術快速，易于實施，并提供出色的探針穩(wěn)定性。取決于所使用的探針，可以鑒定出特定物種的基因組，整個染色體，染色體特異性區(qū)域或單拷貝*序列。
以前的局限性直到近，fish仍受硬件，軟件，試劑，探針技術以及實施該技術涉及的成本的限制。
針對多色fish優(yōu)化的市售顯微鏡硬件直到1990年代中期才面市。在此之前，必須為fish應用定制顯微鏡。大多數(shù)顯微鏡光學系統(tǒng)并非旨在檢測fish信號固有的弱光水平。隨著該技術的基因組分辨率的顯著提高，對顯微鏡光學器件的要求也進一步提高。多個波長之間的色差是個問題。特別是對于多色分析，所有透鏡（包括集光透鏡）都必須進行色校正。另外，落射熒光光源難以對準以均勻照明。
要分析多色fish圖像，需要使用（a）各個激發(fā)塊隔離各種信號。或（b）使用帶有多通二向色和勢壘濾波器的激勵濾光輪。濾光器技術的發(fā)展糾正了由單個濾光器立方體的機械切換引起的光學失準所遇到的一些先前的問題。與多通二向色濾光片和勢壘濾光片一起使用的勵磁濾光輪可以通過對每種顏色采用單獨的勵磁濾光片而沒有套準偏移的方式有效地用于多達三種顏色。但是，對于三種以上的顏色，仍然必須使用單通濾鏡。
高速彩色膠片或ccd（電荷耦合器件）相機被用來收集數(shù)據(jù)，并且色彩保真度存在問題。此外，在單個樣本中疊加使用不同探針獲取的不同顏色圖像的過程也存在限制。
可以定量分析使用熒光試劑制備的樣品的成像軟件也受到限制，因為現(xiàn)有的圖像分析系統(tǒng)并未針對熒光樣品進行優(yōu)化。視覺分析是一項勞動密集型工作，通常是主觀的過程，在某些情況下，如果不使用高級熒光成像功能，則對熒光樣品的分析將非常困難且模棱兩可。研究人員通常必須由軟件開發(fā)人員來創(chuàng)建自己的內部圖像分析軟件。幸運的是，今天制造商提供了許多軟件選項，包括尼康的nis-elements顯微鏡軟件。
試劑和探針本身不足以用于所有應用。例如，雜交位點檢測的效率隨探針尺寸的減小而降低，從而大大限制了通過熒光顯微鏡觀察到的結果。不同顏色的熒光染料的數(shù)量是有限的，并且染料的光穩(wěn)定性差。但是聯(lián)邦政府資助的人類基因組計劃的熒光染料技術和衍生技術的新發(fā)展現(xiàn)在正在產生影響。有所有人類染色體的探針，并且越來越多的新基因特異性探針可供使用。原位雜交試劑盒和熒光標記探針可從幾家公司購得。
成本是另一個主要障礙。由于市場上沒有市售的fish系統(tǒng)，因此研究人員必須組裝定制系統(tǒng)，包括試劑，探針，顯微鏡，成像硬件，軟件以及數(shù)據(jù)分析和報告功能。要同時執(zhí)行多色fish和復雜的圖像分析，研究人員可能要花費20萬美元以上，對于大多數(shù)臨床研究人員而言，這筆錢不容易獲得。結果，許多希望在實驗室中使用fish的研究科學家被禁止這樣做。
fish已廣泛可用許多硬件和軟件制造商已經開發(fā)出了一些方法來創(chuàng)建自定義系統(tǒng)的可負擔的商業(yè)替代方案。參與fish的許多公司和實驗室之間已經形成了合作精神，從而可以取得新的突破。作者將根據(jù)自己的經驗將這些發(fā)展作為此類系統(tǒng)的示例。
在美國使用的系統(tǒng)提供了一種中等價位的商業(yè)化fish研究系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括許多制造商的組件，并依賴于圖像分析軟件，顯微鏡硬件和配件的發(fā)展。臨床研究實驗室將發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可用于多種應用。該系統(tǒng)提供了集成和自動化功能，以終處理臨床測試量。
圖2 -multifluor軟件數(shù)據(jù)屏幕
此處說明的軟件系統(tǒng)是multifluor（tm）多參數(shù)成像軟件（biological detection systems），它是一種基于microsoft® windows（microsoft corp., bellevue, wa）的系統(tǒng)，可以檢測，分析和顯示多色的結構和分子特征。fish樣品。通過關聯(lián)在每個樣品中在各種波長下測量的多個特征，可以提高分析時間和準確性。該系統(tǒng)有助于圖像采集，圖像存儲，數(shù)據(jù)庫管理，顯微鏡自動化控制和全功能圖形數(shù)據(jù)分析。
所示圖2是multifluor軟件數(shù)據(jù)查看屏幕。用戶可以一起查看圖像和相應的數(shù)據(jù)，并使用各種交互式圖形繪圖工具（包括直方圖，散點圖等）將來自多種顏色（波長）的多參數(shù)數(shù)據(jù)進行關聯(lián)。此處，顯示了多個數(shù)據(jù)圖以及所選的多色圖像集細胞（顯示dapi核，fitc-chrx，cy3-chry和cy5-chr21）以及表中顯示的原始數(shù)據(jù)測量值。
fish研究人員可以自動捕獲多個波長和多個焦平面上的圖像，可視化多色fish探針，注釋和打印出圖像，以及存儲和檢索大量的多色圖像數(shù)據(jù)集。可以分析多色fish中期染色體，包括基因作圖，cgh（比較基因組雜交）比率和核型生成。用戶選擇的樣品區(qū)域可以被掃描和分析。該軟件可自動聚焦，獲取多種波長的圖像，記錄細胞的玻片位置并測量多種功能，包括探針計數(shù)，熒光強度和細胞形態(tài)?？梢躁P聯(lián)來自各種波長的多個特征。
該系統(tǒng)的另一個功能是可以與聯(lián)網(wǎng)的個人計算機（pc）一起使用。在典型設置中，一臺pc是連接到相機和顯微鏡硬件的在線分析站。該pc可處理圖像采集和即時分析。其他pc充當輔助檢查站，以分析臺pc產生的結果，或離線執(zhí)行專門的分析。
該軟件允許所有圖像成分以生動的偽彩色顯示，以實現(xiàn)多色同時成像。例如，使用dapi（藍色），fitc（綠色），cy3（紅色）和fitc-cy3（黃色）的組合同時進行四色實驗的圖像都可以單獨顯示，也可以組合以形成彩色合成圖像圖像（如圖1所示）?？梢越换ピ鰪娒總€圖像以顯示感興趣的特征。此外，可以通過該軟件輕松創(chuàng)建直方圖，散點圖，電子表格，折線圖以及其他形式的數(shù)據(jù)列表和查看（圖2）。后，數(shù)據(jù)以易于訪問的流行數(shù)據(jù)庫格式維護，并且可以存儲為tiff，jpeg，gif或其他文件。
落射照明自動化顯微鏡硬件也是系統(tǒng)的一部分。optiphot后來模型顯微鏡系統(tǒng)（尼康儀器公司，梅爾維爾，紐約）有一個自動化的，計算機驅動的xyz載物臺和聚焦系統(tǒng)，設計成存儲每個對象的坐標。因此，只需在重新定位的細胞按鈕上單擊鼠標，即可立即在顯微鏡載玻片上重新調用重要的細胞和染色體位點，從而可以進行更廣泛的顯微鏡視覺檢查或檢查。
顯微鏡系統(tǒng)重要的優(yōu)點之一是為fish應用設計了照明器。quadfluor（tm）和以后的模型落射熒光照明器（nikon instruments inc.）多可容納四個熒光濾光片立方體，并顯著提高亮度和對比度，這對于使用多種熒光染料的研究人員來說是重要的好處。
使用照明器，執(zhí)行fish和其他高級熒光技術的研究人員可以自由地使用四個或更多不同的探頭，而不必停下來更換激發(fā)塊。通過用于在四個濾鏡之間切換的非常精確的線性滑塊的平滑運動，可以確保出色的圖像配準。
濾光片立方體通過使用激勵器，二向色性和擋板濾光器技術提供更高的亮度和很高的對比度；內部擋光板 擋板過濾器的高精度傾斜安裝角度；和專有的抗反射涂層。此外，落射熒光照明器一次多可容納四個立方體，以分離不同的熒光信號，或者可與多波段濾光片立方體一起使用，以同時對幾種熒光染料進行成像。
高透射物鏡對于成像染色體上的微小目標區(qū)域也至關重要。所述cfi60計劃氟目標（尼康儀器公司）設有光學水泥和高透射的涂層，以允許更廣泛的波長范圍和明亮的圖像。物鏡沒有顏色和球差，并且提供*的對比度和極低的背景自發(fā)熒光。
一些制造商目前正在開發(fā)其他計算機控制的顯微鏡附件，以創(chuàng)建*的電動系統(tǒng)，這些系統(tǒng)將是模塊化的，并且對于研究和臨床應用而言價格甚至更低。相機是系統(tǒng)的另一個重要考慮因素?？梢允褂脭?shù)字ccd或增強型攝像機獲取圖像。系統(tǒng)中的關鍵因素是它們在不犧牲保真度的情況下執(zhí)行弱光成像的能力。使用適當?shù)能浖梢酝ㄟ^全自動顯微鏡自動設置相機設置，以確保準確性和易用性。
癌癥，產前和生物學研究與舊的定制系統(tǒng)相比，此處描述的fish系統(tǒng)旨在讓更多的研究人員可以使用，并且正在廣泛用于癌癥研究，病理學，細胞遺傳學和發(fā)育生物學中。它們的應用包括分析相間細胞的多色探針斑點計數(shù)，免疫表型，細胞形態(tài)和dna含量。
該系統(tǒng)正在測試染色體拷貝數(shù)的畸變，該畸變與總dna含量相關，并與膀胱腫瘤有關。在產前研究中，該系統(tǒng)可用于測試與產前缺陷（包括唐氏綜合癥，特納氏綜合癥，克林費爾特氏綜合癥等）相關的相間核的非整倍性。在細胞和發(fā)育生物學研究中，該系統(tǒng)可用于繪制細胞表面標志物（例如受體），細胞質標志物（包括細胞骨架蛋白，信使rna和特定基因）的存在和相對分布。
診斷潛力在過去的十五年中，研究人員已經知道，fish技術具有巨大的潛力，不僅可以用作純粹的研究工具，而且可以用于產前診斷，細胞遺傳學和腫瘤評估等領域的臨床診斷。缺乏高級的，價格適中的系統(tǒng)，不僅減慢了大多數(shù)研究人員使用fish的速度，而且還阻止了該技術在診斷性醫(yī)療保健環(huán)境中不可避免地擴展。
該系統(tǒng)重要的影響之一是它可以提供高級結果，而以前只有昂貴的定制配置系統(tǒng)才能提供。在不久的將來，將fish不僅應用于更廣泛的生物醫(yī)學研究應用中，而且還可以滿足患者的直接需求的夢想可能會成為現(xiàn)實。