脊椎動(dòng)物血管系統(tǒng)的設(shè)計(jì)使局部灌注與每個(gè)組織的代謝需求相匹配，從而優(yōu)化功能并最終存活。例如，缺氧會(huì)在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)擴(kuò)張小阻力血管因子的分泌，而在長時(shí)間內(nèi)則會(huì)誘導(dǎo)刺激血管生成因子的分泌。這些調(diào)整增加了受影響組織的大動(dòng)脈的流量，誘導(dǎo)其向外重塑。相反，組織的wei;suo會(huì)導(dǎo)致血管密度降低和供血?jiǎng)用}向內(nèi)重塑。
排列在血管內(nèi)表面的內(nèi)皮細(xì)胞（ecs）傳遞來自血流動(dòng)力學(xué)壁流體剪切應(yīng)力（fss）的信號(hào)以調(diào)節(jié)血管重塑。多項(xiàng)研究表明，增加或減少動(dòng)脈血流的手術(shù)干預(yù)分別刺激向外或向內(nèi)重塑。目前的證據(jù)支持內(nèi)皮細(xì)胞編碼fss設(shè)定值介導(dǎo)體內(nèi)平衡的模型。持續(xù)高于或低于這個(gè)值的fss會(huì)引起向外或向內(nèi)的重塑，從而使fss恢復(fù)到原始值。相比之下，設(shè)定值附近的fss穩(wěn)定了血管。不同類型的內(nèi)皮細(xì)胞的設(shè)定值不同，對(duì)應(yīng)于特定血管類型的剪切應(yīng)力生理水平。對(duì)于人臍靜脈ecs（huvecs），生理 fss 在 10-20 dynes/cm2 的范圍內(nèi)，抑制炎癥性nf-κb，而smad1/5信號(hào)在此范圍內(nèi)被zui;da;cheng;du激活。
轉(zhuǎn)化生長因子（tgf）-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bmp）家族成員通過信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)，包括從早期發(fā)育階段到成年生活和疾病的增殖，分化和遷移。已經(jīng)表明，tgf-β/bmp家族配體和受體在剪切應(yīng)力調(diào)控血管穩(wěn)態(tài)中的作用。
耶魯大學(xué)心血管研究中心、羅格斯大學(xué)高級(jí)生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中心、上海市免疫學(xué)研究所等研究團(tuán)隊(duì)以前的研究表明，smad1/5在生理設(shè)定值附近的激活和核易位是由其受體alk1和內(nèi)皮糖蛋白觸發(fā)的。流動(dòng)激活是通過對(duì)循環(huán)tgf-β家族配體bmp9和bmp10的敏感性增加約20倍介導(dǎo)的。與血管穩(wěn)定的作用一致，這些受體的突變或缺失會(huì)誘發(fā)脆弱且容易破裂的血管畸形。其他研究表明，相關(guān)的smad2/3通路也被血流激活，但是，在這種情況下，激活被生理層流fss抑制，并由振蕩fss激活，這是動(dòng)脈粥樣硬化易感區(qū)域的典型特征。這些結(jié)果促使該團(tuán)隊(duì)研究了smad2/3信號(hào)在血流依賴性血管重塑中的作用。
剪切應(yīng)力激活smad2/3
用1-30 dynes/cm2 的fss 處理 huvecs 持續(xù)12 小時(shí)誘導(dǎo) smad2/3 核易位，其在低 fss（1-5 dynes/cm2）下達(dá)到最大值，然后隨著fss達(dá)到生理范圍（≥12 dynes/cm2）后顯著降低（圖1 a、b）。細(xì)胞排列的平行評(píng)估（圖1 c）證實(shí)了對(duì)fss的預(yù)期大小反應(yīng)。兩個(gè)smad2/3 直接靶基因—纖連蛋白和整合素α5 的 qpcr 表明，它們的表達(dá)遵循相似的大小依賴性，在低 fss 時(shí)達(dá)到最大值（圖1 d、e）。這種反應(yīng)被小干擾rna（sirna）介導(dǎo)的smad2/3 缺失阻斷，證實(shí)了它們對(duì)smad2/3活性的依賴性。因此，ecs中的smad2/3信號(hào)顯示雙相調(diào)節(jié)，在低fss時(shí)最大。
tgf-β受體通常通過關(guān)鍵絲氨酸殘基的c端磷酸化啟動(dòng)r-smad信號(hào)傳導(dǎo)。因此，實(shí)驗(yàn)研究了剪切應(yīng)力強(qiáng)度（1-30 dynes/cm2）在12小時(shí)內(nèi)對(duì) smad2/3 c 末端磷酸化（p-smad2/3 c）的影響。在 12 小時(shí)的時(shí)間過程中，p-smad2/3 在流動(dòng)開始后約 2-4 小時(shí)達(dá)到峰值，然后下降到高于基線的平臺(tái)期（圖1 f）。然而，與核易位不同，p-smad2/3在高fss下沒有降低。因此，雖然流動(dòng)誘導(dǎo)p-smad2/3 c，但它不像核易位那樣對(duì)fss大小表現(xiàn)出相同的雙相依賴性。因此，在高fss下抑制核定位和基因誘導(dǎo)必須涉及一種du;te的機(jī)制。
圖1 smad2/3受剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)。
受體和配體的鑒定
為了確定哪些受體介導(dǎo)smad2/3的流動(dòng)激活，首先考慮了alk5（tgfβr1），這是tgf-β的主要i型受體，還考慮了神經(jīng)纖毛蛋白-1（nrp1），基于最近的一份報(bào)告，它與alk1和alk5相互作用，并參與vegfr2的fss激活。結(jié)果表明，alk5 和 nrp1 是 smad2/3 流動(dòng)激活所需的關(guān)鍵受體，就像 alk1 和內(nèi)皮糖蛋白是 smad1/5 流動(dòng)激活所需的關(guān)鍵受體一樣。
通過類比smad1/5的流動(dòng)激活中對(duì)bmp9或bmp10的要求，接下來討論了可溶性配體的作用。無血清培養(yǎng)基中fss未能激活細(xì)胞中smad2/3，表示需要一個(gè)或多個(gè)循環(huán)因子。tgf-β是刺激smad2/3活化的主要alk5配體。然而，濃度為1 pg/ml-10 ng/ml的tgf-β2與剪切應(yīng)力沒有協(xié)同作用。由于流動(dòng)增強(qiáng)了bmp9或bmp10對(duì)smad1/5的激活，于是接下來測試了這些配體。結(jié)果表明，fss對(duì)smad2/3活化的增強(qiáng)是由于對(duì)bmp9而非相關(guān)配體的敏感性增加。
誘導(dǎo)的體內(nèi)向內(nèi)重塑
接下來使用部分頸動(dòng)脈結(jié)扎模型檢查了體內(nèi)低流量介導(dǎo)的向內(nèi)重塑。兩個(gè)頸動(dòng)脈分支的結(jié)扎（圖2 a）急劇減少了血流，這通常導(dǎo)致內(nèi)膜-內(nèi)側(cè)增厚和管腔面積減少30%至40%（圖2 b）。對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈血流也有代償性增加，但向外重塑要少得多。實(shí)驗(yàn)首先討論了低fss是否在體內(nèi)激活了smad2/3。大鼠和小鼠的頸動(dòng)脈結(jié)扎（圖2 c、d）后頸動(dòng)脈上游ecs中的smad2/3核染色增加。通過ec特異性敲除（ecko）alk5降低了小鼠的這種作用。因此，smad2/3在體內(nèi)被低fss激活，這需要alk5。
此外，阻斷smad2/3激活是否會(huì)減少低流動(dòng)誘導(dǎo)的動(dòng)脈向內(nèi)重塑。在野生型小鼠中，右頸動(dòng)脈周長減少了18%，對(duì)應(yīng)面積減少了33%，而alk5 ecko小鼠沒有顯著變化（圖2 e）。這些數(shù)據(jù)表明，alk5-smad2/3信號(hào)通路是低流動(dòng)誘導(dǎo)的向內(nèi)動(dòng)脈重塑所必需的。
圖2 低流動(dòng)誘導(dǎo)的體內(nèi)向內(nèi)重塑。
高fss下的抑制
smad2/3 的雙相流動(dòng)激活表明，在高 fss 下激活的另一種通路拮抗 p-smad2/3 核易位。敲除小鼠mekk3通過激活tgfβr1-smad2/3通路觸發(fā)自發(fā)的向內(nèi)動(dòng)脈重塑。mekk2 和 mekk3 是在高 fss 下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 klf2 表達(dá)的途徑中的上游組分。該通路介導(dǎo)enos和其他促進(jìn)血管舒張和穩(wěn)定血管系統(tǒng)的基因表達(dá)。因此，研究了sirna介導(dǎo)的mekk3缺失對(duì)smad2/3信號(hào)流動(dòng)激活的影響。敲低mekk3在低剪切下影響不大，但在高fss下消除了smad2/3核轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制（圖3 a、b）。因此，高-流量抑制smad2/3功能需要mekk3。
接下來，測試了klf2在這條通路中的作用。敲低klf2后，ecs受到不同幅度的fss。同樣，klf2缺失在低fss下幾乎沒有影響，但在高fss下阻止smad2/3的抑制（圖3 c、d）。enos是一種經(jīng)過充分驗(yàn)證的klf2靶基因。兩種不同的抗enos sirnas在高流量條件下對(duì)enos幾乎wan;quan敲低，但對(duì)smad2/3核定位沒有影響。這一結(jié)果表明，必須有其他靶基因介導(dǎo)smad2/3活性的抑制作用。然而，klf2調(diào)控了數(shù)百個(gè)ec基因的表達(dá)，這使得鑒定具有挑戰(zhàn)性。因此需要更仔細(xì)地研究高剪切下核排斥機(jī)制。
圖3 mekk3和klf2在高fss下抑制smad2/3。
smad2/3連接區(qū)磷酸化
smad2/3抑制的一個(gè)重要機(jī)制涉及連接n端mh1和c端mh2結(jié)構(gòu)域的“連接區(qū)”區(qū)域中絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化。因此，實(shí)驗(yàn)測量了低fss和高fss下的smad2/3連接區(qū) 的磷酸化。結(jié)果表明，在高fss下，多個(gè)連接區(qū)域絲氨酸的磷酸化顯著增加。為了確定這種機(jī)制是否介導(dǎo)高fss下的核排斥，轉(zhuǎn)染了四個(gè)關(guān)鍵殘基中攜帶smad3突變的細(xì)胞。該突變體在高剪切下保存細(xì)胞核。接下來又測試了mekk3和klf2在連接區(qū)磷酸化中的作用。任何一種蛋白質(zhì)的缺失都減少了高fss誘導(dǎo)的連接區(qū)磷酸化。這些數(shù)據(jù)共同表明，通過mekk3-klf2通路的高流量誘導(dǎo)的smad2/3連接區(qū)磷酸化介導(dǎo)了高剪切下smad2/3核易位的抑制。
已知的 smad 連接區(qū)激酶包括絲裂原活化蛋白激酶（erk、jnk 和 p38）、周期蛋白依賴性激酶（cdks）、rho相關(guān)蛋白激酶akt、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶和糖原合酶激酶-3。然而，實(shí)驗(yàn)注意到cdk被klf2抑制，并預(yù)測靶向cdks將在高剪切下被激活，從而可能介導(dǎo)觀察到的smad連接區(qū)磷酸化。最近的研究表明，高fss下的動(dòng)脈ecs處于g1停滯晚期，表明cdk4或cdk2的激活。因此，實(shí)驗(yàn)專注于cdk2和cdk4。cdk2的敲低在高剪切下強(qiáng)烈阻斷細(xì)胞中的核排斥，而cdk4 敲低幾乎沒有影響。此外，cdk2 敲低阻斷連接區(qū)磷酸化。綜合這些結(jié)果，得出結(jié)論，cdk2是連接區(qū)磷酸化所必需的。
接下來評(píng)估了klf2調(diào)控的cdk抑制劑（cdkn2b、cdkn1a）的作用。cdkn2b的敲低而不是cdkn1a的敲低逆轉(zhuǎn)了高流量下ecs中klf2缺失的影響。因此，mekk3-klf2通路的cdkn2b下調(diào)，隨后cdk2激活，介導(dǎo)smad2/3連接區(qū)磷酸化和高fss抑制。
cdk在體內(nèi)的抑制作用
最后，研究了該通路是否在體內(nèi)起作用。黃酮吡醇已被用于癌癥患者的人體臨床試驗(yàn)。然而，這種化合物在循環(huán)中的半衰期很短（～30分鐘）。注射高劑量（7.5 mg/kg）黃酮吡啶醇的小鼠肺動(dòng)脈和股動(dòng)脈的內(nèi)皮顯示p-smad2核染色增加數(shù)倍（圖4 a-d）。這些結(jié)果證實(shí)了cdks在動(dòng)脈血流下阻止smad2/3核易位中的作用。接下來，討論了這種處理是否會(huì)引起血管重塑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射3天中的2天的小鼠存活率更高，因此，根據(jù)該方案注射3周。肺血管系統(tǒng)在mekk3 敲低后最容易重塑。對(duì)整個(gè)肺切片的檢查顯示，血管的平滑肌肌動(dòng)蛋白（sma）覆蓋率顯著增加（圖4 e），右心室血壓顯著升高（圖4 f）。
這些數(shù)據(jù)共同定義了一條通路，其中mekk3-klf2-cdk2通過smad2/3連接區(qū)磷酸化抑制高fss下的smad2/3核易位，以限制生理流大小的向內(nèi)重塑。
圖4 cdk在體內(nèi)的抑制作用。
總之，該文分析了調(diào)節(jié)動(dòng)脈管腔大小的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，從而分析了它們將血液輸送到組織的能力。管腔直徑處于嚴(yán)密的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)下，以使動(dòng)脈血流與下游組織的需求相匹配。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化中，這種調(diào)控受到破壞，導(dǎo)致血流受限和組織缺血。闡明smad2/3通路在低流量下被特異性激活以觸發(fā)向內(nèi)重塑，從而恢復(fù)正常的剪切應(yīng)力水平，不僅揭示了生理調(diào)節(jié)的機(jī)制，而且還解釋了病變動(dòng)脈中炎癥因子激活同一通路如何導(dǎo)致動(dòng)脈受限。
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