本實(shí)驗(yàn)采用衰減全反射傅立葉變換紅外光譜法結(jié)合聚類分析方法定性鑒別花椒屬生藥材。結(jié)果顯示，該方法可以有效地鑒別不同產(chǎn)地的花椒藥材，且與經(jīng)典形態(tài)分類學(xué)結(jié)果基本一致，是一種快速、簡便、低耗的新型分析技術(shù)。
花椒為蕓香科植物花椒(zanthoxylum bungesnum maxim．)的干燥成熟果皮，具有祛風(fēng)散寒、活血舒筋、鎮(zhèn)痛等功效。一直以來，傅立葉變換紅外光譜法(fourier transform infrared spectrometry，ftir)是純化合物結(jié)構(gòu)鑒定的有力工具之一。近年隨著ftir方法本身，如衰減全反射(attenuated total reflectance，atr)技術(shù)以及化學(xué)計(jì)量學(xué)的快速發(fā)展，它在復(fù)雜物質(zhì)如細(xì)胞、中藥材等分析領(lǐng)域也有研究應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地的7種花椒屬11個(gè)中藥材樣品為研究對(duì)象，考察了atr-ftir實(shí)驗(yàn)的影響因素，同時(shí)利用聚類分析法鑒別了不同產(chǎn)地的花椒藥材，并與傳統(tǒng)的生藥形態(tài)學(xué)鑒別以及hplc測定結(jié)果進(jìn)行了初步的比較。
1 材料和方法
1．1 樣品、試劑和儀器 l1個(gè)花椒屬樣品由陶朝陽采集，由本院生藥學(xué)教研室陳萬生副教授鑒定，其編號(hào)及采集地點(diǎn)分別為：1～5，刺異葉花椒(z．dimorphophyllum)，湖北鶴峰、湖北興山、陜西平利、陜西略陽、四川萊蒙；6，殼花椒(z．dissitum)，陜西平利；7，異葉花椒(z．ovalifolium)，陜西平利；8，刺花椒(z．a(chǎn)canthopodium)，湖南龍山；9，狹葉花椒(z．stenophyllum)，貴州花溪；10，花椒(z．bungeanum)，貴州畢節(jié)；11，竹葉花椒(z．a(chǎn)rmature)，貴州畢節(jié)。vector 22傅立葉變換紅外光譜儀，atr 附件及opus分析軟件(德國bruker公司)；hplc 分析儀515泵、2487檢測器(美國waters公司)；ywg c18色譜柱10μm，250mm ×4.5 mm(大連依利特公司)。6-(3’-甲基-2’，3'-丁二醇基)-7-乙酰氧基香豆素(sub1)，6-(3’-甲基-2’，3'-丁二醇基)-7-羥基香豆素(sub2) 由花椒中提純，分析純甲醇，重蒸水
1．2 紅外光譜分析 藥材經(jīng)60℃烘干6h，粉碎，過80目篩，取約50mg粉末置于硒化鋅體表面，測定其atr譜，掃
描范圍4000～600/cm，分辨率4/cm，掃描次數(shù)64次。重復(fù)測定5次，求平均光譜，所得光譜求一階導(dǎo)數(shù)光譜。光譜聚類分析采用矢量歸一化法預(yù)處理，以類平均距離為聚類依據(jù)。
1．3 hplc 分析藥材經(jīng)60℃ 烘干6h，粉碎，過80目篩，取粉末100mg，加入10m1甲醇超聲20min，2000r／min離心5min，0.45μm微孔濾膜過濾，重復(fù)3次，合并提取液，減壓濃縮，定容至50.0ml待測。精密配制sub1、sub2，質(zhì)量濃度為：0.208、0.160 mg／ml，分別稀釋成不同濃度，按下述色譜條件測定：流動(dòng)相為甲醇-水(40：60，v/v )，流速：0.5ml／min，進(jìn)樣量10μ1，靈敏度0.5 aufs，檢測波長334nm。
2 結(jié) 果
2．1 影響實(shí)驗(yàn)的因素
2.1．1 粒度大小 取經(jīng)60℃干燥的樣品，粉碎，分別過28、40、80、100目篩，取約50mg樣品在上述光譜條件下測定。結(jié)果顯示，小于60目篩的樣品光譜重現(xiàn)性較差；80、100目樣品光譜的重現(xiàn)性均較好，本實(shí)驗(yàn)取過80目篩的樣品進(jìn)行測定。
2．1．2 分辨率 取上述樣品約50mg，分辨率分別設(shè)置為2、4、8、16、32、64 /cm時(shí)進(jìn)行測定。分辨率為2/cm時(shí)，光譜信息豐富，但噪音的影響也大；分辨率大于8/cm時(shí)，部分樣品信息損失。本實(shí)驗(yàn)采用分辨率為4/cm。
2．1．3 掃描次數(shù) 掃描次數(shù)分別設(shè)置為8、16、32、64、128次進(jìn)行測定，結(jié)果表明，掃描次數(shù)越多，噪音影響越小，但掃描時(shí)間越長。本實(shí)驗(yàn)設(shè)掃描次數(shù)為64次。
2．1．4 譜區(qū)范圍 掃描波長范圍為4000～600/cm，通過全譜區(qū)光譜掃描發(fā)現(xiàn)，1850～700/cm范圍的信息量，本實(shí)驗(yàn)取此譜區(qū)進(jìn)行聚類分析。
2．2 atr-ftir 和一階導(dǎo)數(shù)光譜 從atr光譜及一階導(dǎo)數(shù)光譜圖中可以看到一些細(xì)微的差異，但總體而言其光譜相似程度很大，很難從峰位加以鑒別，其原因主要是中藥有效成分雖有不同，但由于它們?cè)谥兴幊煞种兴急戎剌^少，含量低，信號(hào)弱，因此它們的吸收峰常常被掩蓋。
2．3 聚類分析 由圖2可見，1～ 5、7樣品先聚為一類(除7樣品以外都同屬刺異葉花椒屬)，再與6、8～11樣品聚類，經(jīng)形態(tài)學(xué)分類7樣品為異葉花椒，與刺異葉花椒比較相近，聚類分析結(jié)果與經(jīng)典形態(tài)分類一致。
2．4 hplc測定結(jié)果 5個(gè)刺異葉花椒樣品中sub1和sub2含量較高(除3號(hào)樣品外，含量均>0.008 g／kg)，而其他6種相對(duì)較低(均< 0.006k／kg)。聚類分析結(jié)果與樣品中sub1、sub2含量存在一定的相關(guān)性，提示紅外光譜分析與生藥中活性成分含量存在相關(guān)。
3 討論
常規(guī)的花椒藥材質(zhì)量控制包括鑒別及有效成分含量測定等，前者基本采用顯微鑒別、薄層色譜法等傳統(tǒng)方法；而后者一般采用hplc法。隨著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程，需要從中藥源頭上進(jìn)行藥材種質(zhì)資源及品系道地性的考察等研究，薄層色譜法和hplc法均要求對(duì)樣品做前處理，大量消耗有毒有機(jī)試劑，耗時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜且污染環(huán)境，在系統(tǒng)性、特征性、穩(wěn)定性等方面存在一些問題，需要改進(jìn)才可能適應(yīng)上述的要求；atr-ftir法用于生藥鑒別的結(jié)果準(zhǔn)確與否只取決于制樣的標(biāo)準(zhǔn)化及光譜的信息處理技術(shù)，紅外光譜分析其穩(wěn)定、快速、低耗、無損的檢測方法將優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法，atr-ftir 技術(shù)在生藥鑒別這一領(lǐng)域具有很大的研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值