h9細(xì)胞背景簡介h9(別名wa09)人胚胎干細(xì)胞，1998年由美國干細(xì)胞學(xué)家詹姆斯·湯姆森博士建立，取自早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)呈克隆狀，貼壁生長。該細(xì)胞不需要飼養(yǎng)層細(xì)胞支持，用干細(xì)胞專用matrigel基質(zhì)膠包被培養(yǎng)器皿即可。hesc(h9)細(xì)胞株來源于人胚胎干細(xì)胞，貼壁生長，呈克隆狀，可在hesc/ipsc complete medium中快速增殖，而邊緣分化的細(xì)胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢，從而選擇性擴(kuò)增并獲得高純度人多能干細(xì)胞。
h9人胚胎干細(xì)胞特征h9人胚胎干細(xì)胞系是國際上通用胚胎干細(xì)胞系之一，該細(xì)胞是從人類早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來，具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性?？蔀榧?xì)胞遺傳發(fā)育以及疾病模型研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料。
h9人胚胎干細(xì)胞形態(tài)
h9人胚胎干細(xì)胞熒光檢測
h9人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)h9人胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇方法(以6孔板為例)
1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃，并將matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(15~30℃)。
2. 取4 ml hesc/ipsc complete medium，按照1:4000比例加入1 μl的hesc/ipsc supplement c，恢復(fù)至室溫(15~30℃)。
注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。
3. 取出1支冷凍的細(xì)胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將消失時(shí)取出。
4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的15 ml 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10ml dmem/f12，過程中輕柔晃動(dòng)混勻細(xì)胞，160g離心5 min。
5. 吸棄上清，加入預(yù)溫的4 ml的hesc/ipsc complete medium+hesc/ipsc supplement c制備細(xì)胞懸液，盡量避免吹打。
注：可留20 μl上清液，輕彈管底，使細(xì)胞懸浮液更均勻，避免成較大細(xì)胞團(tuán)。
6. 吸除6孔板中2孔的matrigel包被液，將細(xì)胞懸液按照2 ml/孔接種到1個(gè)孔中。
7. 水平十字搖勻三次，置于37℃，5% co2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。
8. 18-24小時(shí)后換新的hesc/ipsc complete medium，之后每天更換培養(yǎng)基。
注：在hesc培養(yǎng)過程中，如果細(xì)胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的體積增加至3-4ml/孔。
2)h9人胚胎干細(xì)胞傳代方法(以6孔板為例)
1.傳代條件：
① 細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右，一般情況下每3-4天傳代;
② 細(xì)胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。
注：即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。
2. 傳代比例：可根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需要按1:5~1:12的比例進(jìn)行傳代，如果細(xì)胞正常，克隆團(tuán)匯合度85%，大小均勻，建議按照1:8進(jìn)行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。
注：1:8傳代就是1個(gè)孔瓶傳8個(gè)孔(以6孔板為例)。
3. 將 matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(~25℃)。
4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 ml/孔的hesc/ipsc complete medium，并按1：4000比例加入hesc/ipsc supplement c，恢復(fù)至室溫(~25℃)。
5. 將 matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時(shí)恢復(fù)至室溫(~25℃)。
6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 ml/孔的hesc/ipsc complete medium，并按1：4000比例加入hesc/ipsc supplement c，恢復(fù)至室溫(~25℃)。
7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 ml/孔的dpbs(不含鈣鎂)，輕輕搖晃并吸取。
8. 加入2 ml/孔的 hesc/ipsc passage solution使溶液覆蓋孔底。
9. 置于37℃培養(yǎng)箱中孵育8-9 min。
注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時(shí)即可終止消化，若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長消化時(shí)間;
② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。
10. 消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜并吸除hesc/ipsc passage solution。
11. 及時(shí)加入2 ml/孔預(yù)溫的hesc/ipsc complete medium+ hesc/ipsc supplement c，水平十字搖晃6孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì)。
注：① 加hesc/ipsc complete medium + hesc/ipsc supplement c時(shí)，可輕柔吹打細(xì)胞1-2次，不能超過2次，避免反復(fù)吹打;有部分細(xì)胞(10%～15%)未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長消化時(shí)間(< 10min)。 ② hesc細(xì)胞不能長時(shí)間處于hesc/ipsc passage solution(<15 min)，所以收集接種細(xì)胞時(shí)操作必須快速,以及一次操作不要超過4孔(六孔板)。
12. 吸取6孔板中的matrigel溶液，加入預(yù)溫的hesc/ipsc complete medium+ hesc/ipsc supplement c 2 ml/孔。
13. 在6孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。
注：為了鋪板均勻并降低對(duì)細(xì)胞的損傷，可以將步驟9獲得的細(xì)胞懸液收集至2ml離心管，輕柔顛倒混勻細(xì)胞1-2次;再按照傳代比例接種。
14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% co2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。
15. 18-24小時(shí)后更換新hesc/ipsc complete medium，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。
3)h9人胚胎干細(xì)胞凍存方法(以6孔板為例)
1. 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。
2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 ml凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次(p#)、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hesc/ipsc cryopreservation solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。
4. 吸取上清液，加入2 ml/孔的dpbs(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。
5. 加入2 ml/孔的hesc/ipsc passage solution，將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計(jì)時(shí)8-9 min。
6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hesc/ipsc passage solution。
7. 搖勻預(yù)溫的hesc/ipsc cryopreservation solution，每孔加入1 ml凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細(xì)胞懸液加入1.5/2 ml凍存管中。
8. 將細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。
h9人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng) 1.復(fù)蘇h9人胚胎干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞懸液離心后，要避免弄散細(xì)胞團(tuán)，否則將降低細(xì)胞貼壁率和成活率；
2.培養(yǎng)h9人胚胎干細(xì)胞過程中，需要每天換液；
3.如在培養(yǎng)過程中觀察到明顯的分化細(xì)胞集落，及時(shí)刮除；
4.當(dāng)細(xì)胞集落變得較大、中心變得密集和明亮(對(duì)比其邊緣)而相鄰的集落即將融合時(shí)，必須進(jìn)行傳代。細(xì)胞集落融合后很容易自發(fā)分化；
5.如果傳代前觀察到細(xì)胞分化較多，可在鏡下尋找未分化集落并在培養(yǎng)器皿底部標(biāo)記好，消化后(該過程一定不要超過1min)用細(xì)胞刮刀刮下該區(qū)域細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
6.h9人胚胎干細(xì)胞凍存時(shí)同樣要求注意保持細(xì)胞團(tuán)完整。
h9人胚胎干細(xì)胞應(yīng)用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，escs，簡稱es、ek或esc細(xì)胞)是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，es細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型—這象征著它具有非好的醫(yī)療應(yīng)用前景，尤其是移植醫(yī)學(xué)。