中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
qb/t 5759-2022
番茄醬罐頭中番茄紅素含量測定
高效液相色譜法
determination of lycopene in canned tomato paste-hplc method
前言
本文件按照gb/t1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件由中國輕工業(yè)聯(lián)合會提出。
本文件由全國食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會罐頭分技術(shù)委員會（sactc 64/sc2）歸口。
本文件起草單位：上海交通大學(xué)、中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、廈門市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院、華測檢測認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司、新疆新康農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、中糧新疆屯河加工番茄工程技術(shù)研究中心（有限公司）、新疆冠農(nóng)果茸股份有限公司、山西仲測計量研究院有限公司、漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心、中國罐頭工業(yè)協(xié)會。
本文件主要起草人：王正武、仇凱、方榮謙、張維、東思源、柴平海、高靜、何旻霞、譚奇敏、劉中海、吳二豪、王登飛、晁曦、常迪、童躍聰、孫字、戚晨晨、高紅波、崔海濱、肖莉、楊偉敏、陳泳、陳其鋼、申玥琦、張國玉、周璇、張宇聰、趙婭鴻。
本文件為首次發(fā)布。
1范圍
本文件描述了采用高效液相色譜法測定番茄醬罐頭中番茄紅素含量的方法。
本文件適用于采用高效液相色譜法進(jìn)行番茄醬罐頭中番茄紅素含量的測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
試樣在堿性溶液中皂化，經(jīng)鹽酸溶液中和至中性，用有機(jī)溶劑萃取試樣中的番茄紅素，合并有機(jī)相并進(jìn)行濃縮，經(jīng)c30色譜柱分離，高效液相色譜紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量。
5試劑
除另有說明外，所有試劑均為分析純，水為gbt 6682規(guī)定的一級水。
5.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.2甲基叔丁基醚（c5h12o）：色譜純。
5.3二氯甲烷（ch2cl2）。
5.4濃鹽酸（hcl）。
5.5無水乙醇（c2h6o）。
5.6氯化鈉（nacl）。
5.7氫氧化鈉（naoh）。
5.8 2,6-二叔丁基對甲酚（bht）。
5.9石油醚：沸程60℃~90℃。
5.10番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（cas 502-65-8）：包含13z-番茄紅素、9z-番茄紅素、全反式-番茄紅素、
5z-番茄紅素混合物，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度大于95%。
5.11氫氧化鈉溶液（0.5 mol/l）：稱取20g（精確至0.01g）氫氧化鈉（5.7）于500 ml燒杯中，加適量水溶解，待溶液恢復(fù)至室溫后，轉(zhuǎn)移至1 000 ml容量瓶中定容至刻度。
5.12鹽酸溶液（0.6 mo/l）：準(zhǔn)確量取25.0ml濃鹽酸（5.4）于500 ml容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度。
5.13 2,6-二叔丁基對甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5g/l）：準(zhǔn)確稱取0.5g（精確到0.01 g）2,6-二叔丁基對甲酚（bht）（5.8）于燒瓶中加適量二氯甲烷（5.3）溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml棕色容量瓶中，用二氯甲烷（5.3）定容至刻度。
5.14番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100 mg/l）：分別準(zhǔn)確稱取5 mg（精確至0.1 mg）番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)晶（5.10）和10mg2,6-二叔丁基對甲酚（bht）（5.8）（精確至0.1 mg）于燒杯中，用少量二氯甲烷（5.3）溶解，完全轉(zhuǎn)移至50 ml棕色容量瓶中并定容刻度，-20℃避光保存，24 h內(nèi)可使用。
5.15番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液：量取1.0 ml（va）番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（5.14），置于50ml（vb）棕色容量瓶中，加入5.0 ml無水乙醇（5.5）和5.0ml 2,6-二叔丁基對甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5.13），用石油醚（5.9）定容，混勻后將溶液置于1 cm比色皿中，以石油醚（5.9）作空白對照，用紫外-可見光分光光度計在472 nm處測定吸光度。吸光度應(yīng)控制在0.3~0.7，否則應(yīng)調(diào)整溶液濃度，再重新測定吸光度。番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度ρst，按公式（1）計算：
式中：
ρst——番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/l）；
amax——番茄紅素溶液在472 nm附近的最大吸收波長處測得的吸光度值；
d——稀釋因子（ve/va）；
10 000——濃度換算因子；
3 450——番茄紅素的吸光系數(shù)。
5.16番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取0ml、0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.0 ml番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（5.14），用二氯甲烷（5.3）定容至10 ml，得到質(zhì)量濃度為0μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/mll、8.0μgml、10.0μg/ml的番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度按照標(biāo)定的實際濃度計算，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍可根據(jù)標(biāo)定濃度適當(dāng)調(diào)整。
6儀器和材料
6.1高效液相色譜儀：配備紫外檢測器（uv）。
6.2電子天平：感量0.1 mg和0.01 g。
6.3磁力攪拌器。
6.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
6.5渦旋混合器。
6.6振蕩器。
6.7 ph計。
6.8高速離心機(jī)。
6.9有機(jī)微孔濾膜：孔徑0.45μm。
7分析步驟
7.1樣品前處理
稱取0.5g樣品（精確至0.01g）于50ml離心管中，加入5 ml氫氧化鈉溶液（5.11）溶解混勻（渦旋混合器），25℃室溫皂化30 min，分別加入15ml水和2g氯化鈉（5.6），用振蕩器充分振蕩使溶液分散均勻，用鹽酸溶液（5.12）中和至ph=7.0（ph=7±0.1，20℃，ph計），加入20 ml2,6-二叔丁基對甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5.13），用振蕩器振蕩10 min，置于4 000 r/min高速離心機(jī)離心3 min，用玻璃吸管將下層有機(jī)溶液全部轉(zhuǎn)移至250 ml圓底燒瓶中，在上層水相和殘渣中加入20 ml 2,6-二叔丁基對甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5.13），重復(fù)以止操作3次，直至水相和殘渣無色，合并有機(jī)相。
將圓底燒瓶中的有機(jī)溶液在40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮旋蒸至約2 ml，將溶液轉(zhuǎn)移至10 ml的棕色容量瓶中，用2,6-二叔丁基對甲酚（bht）仁氯甲烷溶液（5.13）潤洗圓底燒瓶至少3次，合并潤洗液并定容，濾液經(jīng)0.45μm有機(jī)微孔濾膜過濾，用于液相色譜檢測。
7.2儀器參考條件
7.2.1色譜柱：c30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）或性能相當(dāng)者。
7.2.2流動相：a為甲醇，b為甲基叔丁基醚：三乙胺-100：0.05（體積比）
7.2.3流速：1.0 ml/min.
7.2.4檢測波長：472 nm。
7.2.5柱溫：30℃。
7.2.6進(jìn)樣量：10μl。
7.2.7梯度洗脫條件，見表1。
表1梯度洗脫程序表
時間/min
a/（%）
b/（%）
0
80
20
15
65
35
20
45
55
24
35
65
30
32
68
37
20
80
39
10
90
42
10
90
43
80
20
48
80
20
7.3定性分析
分別將番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.16）和經(jīng)7.1制備的試樣溶液進(jìn)樣測定，以番茄紅素的保留時間定性，定性色譜圖見附錄a。
7.4外標(biāo)法定量
將7.1制備的試樣注入高效液相色譜儀，測定試樣中各組分譜峰面積，以番茄紅素標(biāo)定后的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以番茄紅素各異構(gòu)體的峰面積和為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計算試樣中番茄紅素的含量。
7.5結(jié)果計算
將樣品中番茄紅素的含量按公式（2）計算：
式中：
x——桃合一樣品中番茄紅素的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；
ρ——待測溶液中番茄紅素總質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μg/ml）；
v——溶液的定容體積，單位為毫升（ml）；
100——換算因子；
m——樣品質(zhì)量，單位為克（g）；
1000——換算因子。
測定結(jié)果取兩次測定的算術(shù)平均值，計算結(jié)果保留至小數(shù)點后2位。
7.6精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過其算術(shù)平均值的10%。
7.7檢出限和定量限
本文件中番茄紅素的檢出限為0.30 mg/100g，定量限為1.00 mg/100g。