11月16日，普諾賽直播間為大家介紹了懸浮細胞的生長特點、培養(yǎng)注意事項，并通過thp-1、nk-92、nci-h209三個細胞案例，深入講解了懸浮細胞的培養(yǎng)要點。直播回放可移步至b站-“普諾賽生物”進行觀看。本期直播答疑，從直播間提問中，篩選出部分有代表性的問題，做了詳細解答。
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q1
傳代時，細胞密度比較低，但是培養(yǎng)基又
變黃了，怎么辦？
細胞培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)細胞量較少，但培養(yǎng)基變黃較快，可以從以下3個方面進行排查：
?檢查培養(yǎng)基成分是否正常，如nahco3濃度是否偏低；
? 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)co2濃度是否過高，一般培養(yǎng)基添加濃度為1.5g/l或2.2g/l的nahco3，使用5% co2進行平衡；添加濃度為3.7g/l的nahco3可使用10% co2進行平衡；
? 是否存在某種污染物，與細胞競爭營養(yǎng)，導致培養(yǎng)基快速消耗。一般先排除細菌和真菌污染，通過培養(yǎng)法檢查即可（不加抗生素培養(yǎng)檢查），如排除細菌和真菌污染，可進行支原體檢測，確定是否存在支原體污染。
q2
半換液算傳代嗎？怎么計算代數(shù)？
對于有限傳代的細胞，細胞的代次可以用以下公式進行計算：
pdl =x+3.322(log y – log i)
其中x為傳代前代次 ; i 為細胞接種前細胞數(shù)；y 為培養(yǎng)后細胞總數(shù)
對于腫瘤細胞或無限傳代的細胞，傳代數(shù)僅僅代表操作的次數(shù)，與傳代比例和細胞增殖數(shù)量沒有直接關(guān)系；
半量換液的細胞，如果沒有進行分瓶培養(yǎng)，建議按照常規(guī)的換液來計算，不計入傳代次數(shù)，如加入新鮮培養(yǎng)基后分瓶培養(yǎng)，則可以將傳代數(shù)+1。
q3
本來成團生長的細胞，不成團了怎么辦？
細胞是否成團生長，一般是跟細胞本身特性以及培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)的。
如果是本來成團生長的細胞，分散不成團，且增殖速度變慢，可能是細胞狀態(tài)變差的癥狀。一般可以從是否污染（特別注意支原體檢查）、細胞培養(yǎng)基或血清是否變更以及操作過程是否對細胞產(chǎn)生損傷這三個方面進行排查。
如果細胞僅僅是變成分散狀態(tài)，但是生長指標都正常，則可能是由于培養(yǎng)條件或環(huán)境改變導致的，只要細胞生長正常且沒有其他異常癥狀，不需要過度關(guān)注。
q4
懸浮細胞復蘇4-5天進行凍存會影響
細胞活率嗎？
細胞是否適合凍存取決于細胞的生長狀態(tài)，用于凍存的細胞一般要求狀態(tài)良好，并處于快速增殖階段。
對于生長速度較快的懸浮細胞，4-5天可以傳代1-2次，狀態(tài)基本恢復，保證細胞處于生長旺盛的對數(shù)生長期即可凍存；
但是對于生長速度慢的細胞，4-5天細胞可能還處于狀態(tài)恢復中，沒有大量增殖，此時凍存可能會影響后續(xù)復蘇的狀態(tài)。建議復蘇后的細胞，培養(yǎng)1-2代，細胞狀態(tài)良好時進行凍存。
q5
培養(yǎng)thp-1細胞兩周，培養(yǎng)液很容易變
黃，聚團很嚴重，中間有黑渣渣，怎么辦？
如果細胞量沒有明顯增加，培養(yǎng)基很容易變黃，黑點多且細胞聚團嚴重，懷疑細胞是存在某種污染，需要排除污染源后重新培養(yǎng)。
q6
thp-1有少量貼壁細胞怎么處理？
如果出現(xiàn)少量貼壁，每次傳代培養(yǎng)時，只收集懸浮部分即可；如果需要完-全不貼壁，可以選擇低吸附的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。
q7
培養(yǎng)幾天后，懸浮細胞的培養(yǎng)基是不是
會變渾濁些？
懸浮細胞和貼壁細胞不一樣，培養(yǎng)上清是略顯渾濁的，隨著細胞量的增加渾濁度也會增加。
可以通過鏡檢結(jié)果來與細菌等污染物進行區(qū)分，鏡檢細胞懸液，細胞間隙應(yīng)該是干凈的，但污染的細胞間隙一般是大量黑色顆粒，有些可以觀察到明顯的運動。
q8
thp -1細胞量挺多，但培養(yǎng)基長時間不
變黃，有什么辦法？
培養(yǎng)基是否變黃只是細胞傳代的參考指標。培養(yǎng)基變黃主要是細胞代謝產(chǎn)物積累導致，同時也會受到培養(yǎng)基的緩沖體系以及培養(yǎng)箱co2濃度的影響。如果細胞生長正常，并且到了傳代的量，則可以正常傳代。
對于thp-1細胞來說，如果細胞數(shù)量足夠但是培養(yǎng)基不變黃，可能是由于細胞接種時培養(yǎng)基ph值偏高（可能是培養(yǎng)基開啟時間過長，co2溢出導致的ph值升高），細胞數(shù)量雖多但沒有明顯代謝和增殖，所以顏色不容易變黃。所以建議不要直接分瓶，可以換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)觀察。
q9
sf9細胞靜置培養(yǎng)時正常，轉(zhuǎn)入搖瓶懸浮
培養(yǎng)，停滯不長，但也沒死，是培養(yǎng)基不
適合懸浮培養(yǎng)嗎？
細胞培養(yǎng)條件的變更，如更換培養(yǎng)基，或者由靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)為搖瓶培養(yǎng)，都需要一個馴化和適應(yīng)的過程。
馴化過程，簡單說就是緩慢更換培養(yǎng)條件，如將新舊培養(yǎng)基按比例混合，讓細胞逐步適應(yīng)，或者在搖瓶培養(yǎng)前期，調(diào)低搖床轉(zhuǎn)速，讓細胞逐漸適應(yīng)。將細胞直接轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基或培養(yǎng)環(huán)境可能導致細胞不長甚至死亡的情況。