1.目的明確
培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件;培養(yǎng)目的不同,原料的選擇和配比不同;例如枯草芽孢桿菌:
一般培養(yǎng):肉湯培養(yǎng)基或lb培養(yǎng)基;
自然轉(zhuǎn)化:基礎(chǔ)培養(yǎng)基;
觀察芽孢:生孢子培養(yǎng)基;
產(chǎn)蛋白酶:以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基;
根據(jù)不同的工作目的,微生物不同的營養(yǎng)需要,運(yùn)用自己豐富的生物化學(xué)和微生物學(xué)知識來配制z佳的培養(yǎng)基。
2.營養(yǎng)協(xié)調(diào)
微生物細(xì)胞組成元素的調(diào)查或分析,是設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時的重要參考依據(jù)。
微生物細(xì)胞內(nèi)各種成分間有一較穩(wěn)定的比例。
在大多數(shù)化能異養(yǎng)菌的培養(yǎng)基中,各營養(yǎng)要素間在量上的比例大體符合以下十倍序列的遞減規(guī)律:
要素:h2o>c源+能源 >n 源 >p、s>k、mg>生長因子
含量:(~10-1) (~10-2) (~10-3) (~10-4) (~10-5) (~10-6)
a.選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì),實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基:
細(xì)菌:牛肉-膏蛋白胨培養(yǎng)基(或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基);
放線菌:高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng);
酵母菌:麥芽汁培養(yǎng)基;
霉菌:查氏合成培養(yǎng)基;
實(shí)驗(yàn)室一般培養(yǎng):普通常用培養(yǎng)基;
遺傳研究:成分清楚的合成培養(yǎng)基;
生li、代謝研究:選用相應(yīng)的培養(yǎng)基配方;
b.營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適
營養(yǎng)物質(zhì)的濃度適宜, 營養(yǎng)物質(zhì)之間的配比適宜;
高濃度糖類物質(zhì)、無機(jī)鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進(jìn)微生物的生長,反而起到抑制或殺菌作用。
培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和(或)代謝產(chǎn)物的形成和積累,其中碳氮比(c/n)的影響較大。
真菌需c/n比較高的培養(yǎng)基;(素食)
細(xì)菌(動物病原菌)需c/n比較低的培養(yǎng)基;(葷食)
發(fā)酵生產(chǎn)*時:
碳氮比為4/1時,菌體大量繁殖,*積累少;
碳氮比為3/1時,菌體繁殖受到抑制,*產(chǎn)量則大量增加。
nh3 > co(nh2)2 > nh4no3 > (nh4)2co3 > (nh4)2so4
含氮量(82%)(46%) (35%) (29.2%) (21%)
這說明在同樣重量時,在以上各氮源中含氮量以氨為z高,尿素次之,硝-酸銨和碳酸銨更次之,而硫酸銨則z低。
3.理化適宜
指培養(yǎng)基的ph值、滲透壓、水活度和氧化還原電勢等物理化學(xué)條件較為適宜。
包括:ph、滲透壓和水活度、氧化還原電位
(1) ph
各大類微生物都有其生長適宜的ph范圍,培養(yǎng)基的ph必須控制在一定的范圍內(nèi),以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。
通常培養(yǎng)條件:(初始ph )
細(xì)菌: ph 7.0~8.0
放線菌:ph 7.5~8.5
酵母菌: ph 3.8~6.0
霉菌:ph 4.0~5.8
藻類: ph 6.0~7.0
原生動物: ph 6.0~8.0
嗜極菌(extremophiles)
在微生物的生長、代謝過程中會產(chǎn)生引起培養(yǎng)基ph改變的代謝產(chǎn)物,為了維持培養(yǎng)基ph的相對恒定,通常要進(jìn)行ph的調(diào)節(jié)。
ph的調(diào)節(jié)包括ph的內(nèi)源調(diào)節(jié)和ph的外源調(diào)節(jié)。
a.ph的內(nèi)源調(diào)節(jié):通過培養(yǎng)基內(nèi)在成分所起的調(diào)節(jié)作用,就是ph的內(nèi)源調(diào)節(jié)。
第1種是采用磷酸緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[k2hpo4]/[kh2po4]=1時,溶液的ph穩(wěn)定在6.8。
調(diào)節(jié)k2hpo4和kh2po4兩者濃度比可獲得ph 6.0~7.6間的一系列穩(wěn)定的ph。
反應(yīng)原理:
k2hpo4+hcl→kh2po4+kcl kh2po4+koh→k2hpo4+h2o
第二種以caco3作“備用堿”進(jìn)行調(diào)節(jié)。caco3(不溶于水又是沉淀性的,在培養(yǎng)基中分布
不均勻)、nahco3均可用來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph。
b.ph的外源調(diào)節(jié):
這是一類按實(shí)際需要不斷從外界流加酸或堿液,以調(diào)整培養(yǎng)液的方法。
(2) 滲透壓和水活度
滲透壓(osmotic pressure)是某水溶液中一個可用壓力來量度的一個物化指標(biāo)。
它表示兩種濃度不同的溶液間被一個半透性薄膜隔開時,稀溶液中的水分子會因水勢(water potentiality)的推動而透過隔膜流向濃溶液,直到濃溶液產(chǎn)生的機(jī)械壓力足以使兩邊水分子的進(jìn)出達(dá)到平衡為止,這時由濃溶液中的溶質(zhì)所產(chǎn)生的機(jī)械壓力,即為它的滲透壓值。
與微生物細(xì)胞滲透壓相等的等滲溶液z適宜微生物的生長;
高滲溶液會使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離;
低滲溶液則會使細(xì)胞吸水膨脹,形成很高的膨壓,這對細(xì)胞壁脆弱或喪失的各種缺壁細(xì)胞,例如原生質(zhì)體、球狀體或支原體來說,則是致命的。
水活度即aw(wateractivity)是一個比滲透壓更有生li意義的一個物化指標(biāo)。它表示在天然或人為環(huán)境中,微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水的含量。
各種微生物生長繁殖范圍的aw值在0.998~0.6之間:
(3)氧化還原電勢(redox potential)
又稱氧化還原電位,是度量某氧化還原系統(tǒng)中還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標(biāo)。
一般以eh表示,它是指以氫電極為標(biāo)準(zhǔn)時某氧化還原系統(tǒng)的電極電位值,單位是v(伏)或mv(毫伏)。
不同類型微生物生長對氧化還原電位的要求不同:
好氧性微生物:+0.1伏以上時可正常生長,以+0.3~+0.4伏為宜;
厭氧性微生物:低于+0.1伏條件下生長;
兼性厭氧微生物:+0.1伏以上時進(jìn)行好氧呼吸,+0.1伏以下時進(jìn)行發(fā)酵。
氧化還原電位與氧分壓和ph有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響:
增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓,或加入氧化劑,從而增加eh值在培養(yǎng)基中加入巰基乙醇、抗壞血酸(vc,0.1%)、硫化qin(0.025%)、半*(<0.05%)、*、鐵屑、二硫蘇糖醇、庖肉(瘦牛肉粒)等還原性物質(zhì)可降低eh值。
測定氧化還原電勢除用電位計(jì)外,還可在培養(yǎng)基中加入化學(xué)指示劑刃天青(resazurin)進(jìn)行間接測定。
刃天青在無氧條件下呈無色(eh=-40 mv);在有氧條件下,其顏色與溶液的ph相關(guān);(中性——紫色;堿性——藍(lán)色;酸性——紅色);在微量氧時,它呈粉紅色。
4.經(jīng)濟(jì)節(jié)約
配制培養(yǎng)基時應(yīng)盡量利用廉價且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成份,特別是在發(fā)酵工業(yè)中,以降低 生產(chǎn)成本。
(1)以粗代精:對微生物來說,各種粗原料營養(yǎng)更加*,效果更好。而且在經(jīng)濟(jì)上也節(jié)約。大量的農(nóng)副產(chǎn)品或制品,如麩皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅、蛋白胨等都是常用的發(fā)酵工業(yè)原料。
(2)以“野”代“家”: 以野生植物原料代替栽培植物原料,如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉質(zhì)的野生植物,可以部分取代糧食用于工業(yè)發(fā)酵的碳源。
(3)以廢代好:以工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中易污染環(huán)境的廢棄物作為培養(yǎng)微生物的原料。例如,糖蜜(制糖工業(yè)中含有蔗糖的廢液)、乳清(乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液)、 豆制品工業(yè)廢液、黑廢液(造紙工業(yè)中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿)等。
工業(yè)上的甲烷發(fā)酵主要利用廢水、廢渣作原料,在我國農(nóng)村,已推廣利用糞便及禾草為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲烷作為燃料。
(4)以簡代繁:某制藥廠改進(jìn)*發(fā)酵液中的原有配方,設(shè)法減去30-50%的黃豆餅粉、25%的葡萄糖和20%硫酸銨,結(jié)果反而提高了產(chǎn)量。
(5)以氮代朊:以大氣氮、銨鹽、硝酸鹽或尿素等一類非蛋白質(zhì)或非氨基酸廉價原料用作發(fā)酵培養(yǎng)基的原料,讓微生物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白質(zhì)或含氮的發(fā)酵產(chǎn)物供人們利用。
(6)以纖代糖:開發(fā)利用纖維素這種世界上含量豐富的可再生資源。將大量的纖維素農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)變?yōu)閥ou質(zhì)飼料、工業(yè)發(fā)酵原料、燃料及人類的食品及飲料。
(7)以“國”代“進(jìn)”: 以國產(chǎn)原料代替進(jìn)口原料,盡量減少工業(yè)成本。國內(nèi)*發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展,依賴于找到了富有中國特色的培養(yǎng)基配方,即用廉價的棉子餅(或花生餅)和白玉米粉代替玉米漿和乳糖。