488 caspase-3活細胞分析試劑盒說明書
產(chǎn)品描述
活細胞分析試劑盒包含 488 caspase-3底物和ac-devd-cho caspase-3/7抑制劑。 488 caspase-3 substrate為基于caspase-3/7活力檢測細胞凋亡提供了有效的工具，適用于熒光顯微觀察和流式細胞儀分析。
相較于其它基于（flica）分析的 caspase 的熒光底物或熒光抑制，試劑盒內(nèi)提供的substrate 檢測caspase-3/7 活性的同時不會抑制完整細胞的凋亡過程。substrate由耦合caspase-3/7 devd識別序列的熒光dna染料組成。substrate 最初無熒光，其會穿過細胞膜進入細胞質(zhì)。在凋亡細胞中caspase-3/7剪切substrate釋放高親和性的dna 染料，這種染料遷移到細胞核標記dna 并發(fā)出明亮的綠色熒光。substrate 是雙功能的，既可以檢測 caspase-3/7 活性，又能可視化細胞核在細胞凋亡進行中的形態(tài)學(xué)變化。
使用方法
使用方法
1. 實驗優(yōu)化下面提供的實驗步驟根據(jù)終點法檢測制度。488 substrate 可進行細胞長時間孵育過程研究。細胞密度、底物濃度和抑制劑濃度可能需要優(yōu)化。推薦底物濃度1-10 μm之間。細胞可在培養(yǎng)基、pbs或其他的緩沖液中孵育底物。對于貼壁細胞，建議更換新鮮含有底物的培養(yǎng)基，以防背景的不均一性。底物孵育后換液或洗滌細胞等操作可自由選擇。2. 對照設(shè)定
推薦設(shè)定以下對照：
a. 陰性對照：不誘導(dǎo)凋亡的細胞
b. 陽性對照：誘導(dǎo)凋亡的細胞
c. 抑制劑對照：誘導(dǎo)細胞凋亡同時（或提qian10-30 min）孵育caspase-3/7抑制劑，最后再添加 488 caspase-3底物。
3. 抑制劑對照
試劑盒中所提供的caspase-3/7 抑制劑 ac-devd-cho 可用來確認caspase-3/7 依賴于 488 的熒光信號。對于抑制劑對照，抑制劑的終濃度應(yīng)至少是底物濃度的2倍（例如當使用5 μm 488 底物時，ac-devd-cho濃度為 10 μm）。添加底物前在室溫下孵育ac-devd-cho 15-30 min，加入底物后，孵育液中繼續(xù)保留抑制劑。ac-devd-cho 是可逆的競爭性抑制劑。對于某些細胞類型有效的caspase-3/7 抑制劑需要使用不可逆的抑制劑，如z-devd-fmk，或需要在凋亡誘導(dǎo)之前或誘導(dǎo)過程中添加抑制劑。
4. 流式細胞儀分析
4.1 選擇合適的方法誘導(dǎo)細胞凋亡，未經(jīng)處理的細胞樣本作為對照。
4.2 對于貼壁細胞，實驗前先用胰蛋白酶或其他方法消化細胞。
4.3 用細胞培養(yǎng)基或合適緩沖液重懸細胞，使細胞密度達到106個/ml數(shù)量級。
4.4 添加200 μl 細胞懸液至流式細胞試管。
4.5 抑制劑對照樣本，用ac-devd-cho 處理細胞（見上文）。
4.6 200 μl細胞懸液中加5 μl 0.2 mm 的substrate并立即混勻使底物濃度為5 μm。不同類型細胞最佳底物濃度可能不同，需進一步優(yōu)化。
4.7 室溫避光孵育15-30 min。
4.8 加入300 μl細胞培養(yǎng)基或pbs，使用流式細胞儀分析，選擇檢測綠色熒光的通道（激發(fā)/發(fā)射：485/515 nm）。
5. 熒光顯微鏡觀察
5.1 選擇合適的方法誘導(dǎo)細胞凋亡，未經(jīng)處理的細胞樣本作為對照。
5.2 抑制劑對照樣本，用ac-devd-cho 處理細胞（見上文）。
5.3 用含5 μm substrate 的新鮮培養(yǎng)基或pbs對細胞進行換液（見試驗優(yōu)化）。對于抑制劑對照組，抑制劑與底物一同孵育。
5.4 室溫孵育30 min 或更長時間。
5.5 pbs或其它緩存液清洗細胞，熒光顯微鏡觀察細胞，使用觀察綠色熒光的濾片（激發(fā)/發(fā)射：485/515 nm）。
6. 熒光酶標儀檢測
6.1 將貼壁細胞生長在黑色96孔板中；對于懸浮細胞，調(diào)整密度至106個/ml，每孔加入0.2 ml細胞懸液。
6.2 選擇合適的方法誘導(dǎo)細胞凋亡，未經(jīng)處理的細胞樣本作為對照。（注意：細胞可能在管或瓶中處理，然后轉(zhuǎn)移到 96孔檢測板。）
6.3 抑制劑對照樣本，用 ac-devd-cho 處理細胞（見上文）。
6.4 對于懸浮細胞，直接添加substrate 混勻。對于貼壁細胞，用含有5 μm substrate的新鮮培養(yǎng)基或pbs對細胞進行換液（見試驗優(yōu)化）。對于抑制劑對照組，抑制劑與底物一同孵育。
6.5 細胞可以在含有substrate 的培養(yǎng)基中直接觀察。
6.6 對于懸浮細胞，輕輕震蕩重懸細胞。熒光酶標儀設(shè)置激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長520 nm。建議貼壁細胞使用底部閱讀方式。貼壁細胞密度的變化可能導(dǎo)致不準確的讀數(shù)。
運輸及保存方法
冰袋（wet ice）運輸。儲存于4oc，至少可以儲存12個月。
注意事項
1、細胞可用hoechst 33342 染料（推薦濃度1 μm）共染，使細胞核產(chǎn)生藍色熒光染色（ex/em=346/460 nm）。
2、488 染料可用甲醛固定，但與甲醇固定不兼容。
3、經(jīng)甲醛固定的488染色細胞可用0.1% tritonx-100處理后行后續(xù)染色，但這樣處理后的染色亮度可能會減弱。
4、操作時請采取防護措施，穿防護服、戴一次性手套等。5、本產(chǎn)品僅作科研用途！
貨號 品名 規(guī)格 品牌
78dc10160-25t 488 caspase-3活細胞分析試劑盒 25t biohub
78dc10160-100t 488 caspase-3活細胞分析試劑盒 100t biohub