漲知識 | 克隆專題七：分子克隆應用工具克隆技術，又稱為“生物放大技術”，目前應用 泛的技術為“分子克隆”，即通過重組技術將目的dna片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、ta克隆、gatway克隆、topo克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉化、篩選等等步驟。其中，設計引物、載體和片段，都需要使用相應的分子克隆工具進行操作和模擬，接下來小翌會以同源重組為例，具體解析一下分子克隆技術中應用到的那些工具，為您的實驗提供好方法。
01基因組序列查詢工具
進行分子克隆實驗之前，需要根據(jù)下游實驗目的，確認實驗中應用到的片段物種并查找序列。假設需要在自己的載體上加入人基因組dna，可以使用ncbi（干貨在線查詢，選擇“nucleotide”，輸入“human”，點擊查詢后，獲得5000多萬條基因序列，如圖1所示。
圖1. ncbi基因序列查詢
點擊序列如智人kir3dl2蛋白的mrna序列（kir3dl2基因），進入界面后會給出該基因的來源物種、詳細名稱、功能描述、文獻出處、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。點擊右上角的“send to”可以獲得該基因的完整序列（純文本格式）。
圖2. ncbi基因序列下載
02目的片段和載體引物設計工具
獲得目的片段后，根據(jù)同源重組原理，需要在插入片段的上下游引入15-25 bp的同源臂，gc含量40-60%，以保證片段與載體充分接觸并進行重組?？梢酝ㄟ^翌圣“支持中心”的“同源重組引物設計”點擊進入，或者直接點擊無縫克隆引物設計軟件進行設計引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點（不建議選擇載體和片段中都含有的酶切位點），生成引物，如圖3、4所示。
圖3. 翌圣設計軟件
圖4. 翌圣引物設計流程
值得注意的是，多個目的片段插入的雙酶切位點，實際添加到第一個片段的5’端和最后一個片段的3’端，中間片段不含有設計的酶切位點。通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著使用翌圣高保真pcr試劑盒（cat#10164es）pcr擴增目的片段與載體。
03載體設計模擬軟件
當設計完目的片段后，需要對載體和片段進行模擬連接，保證實驗的準確性?？梢允褂胹napgene軟件模擬。以puc19為載體，kir3dl2基因為插入片段，進行克隆連接模擬。選擇“actions”—“gibson assembly”—“insert fragment”，輸入相應的插入片段和載體序列，如下圖5所示，即可生成連接后的載體。點擊新生成載體的“history”可以模擬載體與片段連接的具體步驟，如圖6所示。
圖5. snapgene同源重組模擬流程
圖6. snapgene同源重組模擬圖
模擬步驟后，即可使用翌圣新品通用型多片段快速克隆試劑盒（cat#10923es）連接目的片段，該試劑盒滿足6 μl小體系、10 ng低濃度載體與片段的連接，菌落數(shù)多，克隆陽性率高，客戶反饋效果好，如圖7所示。
小體系低濃度載體高效率重組實驗信息：載體大?。?369 bp；目的片段大?。?589 bp。
實驗數(shù)據(jù)：
圖7.10923es在10 μl小反應體系下，低濃度載體（30 ng）連接單片段，陽性率100%。a：重組轉化平板。b：插入片段pcr鑒定電泳圖，泳道1-5分別為菌落1，菌落2，陰性對照，陽性對照（基因組作為模版），陽性對照（pcr純化片段作為模版）。（上海交通大學）
除了上述基礎的分子克隆技術應用工具外，還有如紐約大學研究人員開發(fā)的grna在線設計軟件 ，用于設計crispr-cas13的grna引物等。分子克隆應用工具多種多樣，應用好工具，能為我們的實驗添磚加瓦。小翌在這里祝您實驗順利，一氣呵成！關注我們，小翌會在下一期繼續(xù)帶來分子克隆方面的知識，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
04相關產(chǎn)品列表
產(chǎn)品定位
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品貨號
規(guī)格
高保真pcr
2× hieff canace® advancefast pcr master mix (with dye)
10164es03/08
1 ml/5×1 ml
1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應
hieff clone® universal ii one step cloning kit
10923es20/50
20 t/50 t
通用緩沖液，5min完成精準酶切
funicut™快速限制性內(nèi)切酶
15001es-15051es
50 t
快速pcr，快至1s/kb
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1 ml/5×1 ml