中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb 5009.210-2023
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測定
前言
本標(biāo)準(zhǔn)代替gb 5009.210-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測定》。
本標(biāo)準(zhǔn)與gb 5009.210-2016相比，主要變化如下：
——增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；
——修改了微生物法試樣的前處理方法，并增加了微孔板測定方法。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中泛酸的測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于嬰幼兒配方食品（除特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品外）、嬰幼兒輔助食品、乳制品、飲料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑中泛酸的測定。
本標(biāo)準(zhǔn)第二法和第三法適用于食品中泛酸的測定。
第一法液相色譜法
2原理
試樣用熱水提取后，經(jīng)c18反相色譜柱分離，以保留時間定性，外標(biāo)法定量。
3試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
3.1試劑
3.1.1鹽酸（hcl）。
3.1.2磷酸（h3po4）。
3.1.3磷酸二氫鉀（kh2po4）。
3.1.4七水合硫酸鋅（znso4·7h2o）。
3.1.5乙腈（ch3cn）：色譜純。
3.1.6 a-淀粉酶：酶活力≥1.5 u/mg。
3.2試劑配制
3.2.1鹽酸（0.1 mol/l）：吸取8.3 ml鹽酸至800 ml水中，加水稀釋至1 000 ml，混勻。
3.2.2鹽酸（1.0 mol/l）：吸取8.3 ml鹽酸至80 ml水中，加水稀釋至100 ml，混勻。
3.2.3硫酸鋅溶液（0.5 mol/l）：稱取14.4 g七水合硫酸鋅，加水溶解并稀釋至100 ml。
3.2.4磷酸二氫鉀溶液（0.02 mol/l）：稱取2.722 g磷酸二氫鉀，加500 ml水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)ph至3.0±0.1，用水稀釋至1 000 ml，用0.45μm濾膜過濾。
3.3標(biāo)準(zhǔn)品
d-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（c18h32can2o10，cas號：137-08-6）：純度≥99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)品。
3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
3.4.1泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500μg/ml）：準(zhǔn)確稱取136 mg d-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg），加水溶解并轉(zhuǎn)入到250 ml容量瓶中，稀釋至刻度，混勻。標(biāo)準(zhǔn)儲備液-18℃及以下避光保存，可保存3個月。
3.4.2泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100μg/ml）：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液20.0ml于100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度。臨用現(xiàn)配。
3.4.3泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml、8.0 ml、16.0 ml和32.0 ml于100 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，得到濃度分別為1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml和32.0μg/ml的泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。臨用現(xiàn)配。
4儀器和設(shè)備
4.1天平：感量0.1 mg。
4.2恒溫振蕩水浴箱：振蕩頻率100 r/min±20 r/min。
4.3超聲波振蕩器。
4.4 ph計：精度為±0.01。
4.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥8000 r/min。
4.6 0.45μm濾膜。
4.7高效液相色譜儀：帶紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
5分析步驟
5.1試樣制備
固態(tài)試樣粉碎并混合均勻。碳酸飲料需超聲波去除二氧化碳，其他液態(tài)試樣搖勻。
5.2試樣提取
5.2.1飲料、營養(yǎng)素補(bǔ)充劑
準(zhǔn)確稱取或量取適量試樣，精確至0.001 g，一般固體試樣0.2 g~2 g，液態(tài)試樣10 g~20 g，置于50ml錐形瓶中，加入約30ml 40℃~50℃溫水超聲提取20min。轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，用水稀釋至刻度并充分混勻后，轉(zhuǎn)入離心管，8 000 r/min離心2 min，取上清液過0.45μm濾膜，濾液待上機(jī)測定。
5.2.2嬰幼兒配方食品（除特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品外）、嬰幼兒輔助食品、乳制品準(zhǔn)確稱取適量試樣，精確至0.00 1 g，一般固態(tài)試樣約5 g，液態(tài)試樣約20 g。置于100 ml錐形瓶中，加入約30 ml 40℃~50℃溫水。不含淀粉試樣，直接超聲提取20 min。含淀粉試樣，加入a-淀粉酶0.2 g，振搖混勻，蓋上瓶塞，在55℃±5℃水浴條件下振搖酶解30 min，取出試樣液，冷卻至室溫。
用0.1 mol/l鹽酸或1.0 mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至5.0±0.1，加入5 ml 0.5 mol/l硫酸鋅溶液，充分混合。轉(zhuǎn)入50 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度并充分混勻后，轉(zhuǎn)入離心管，8000 r/min離心2 min，取上清液過0.45μm濾膜，濾液待上機(jī)測定。
5.3液相參考色譜條件
液相參考色譜條件如下：
a）色譜柱：ods-c18（粒徑5μm，250 mm×4.6 mm）或具有同等性能的色譜柱。
b）柱溫：35℃±0.5℃。
c）檢測波長：200 nm。
d）流動相：0.02 mol/l磷酸二氫鉀溶液乙腈（95+5）。
e）流速：1.0 ml/min。
f）進(jìn)樣量：10μl或20μl。
5.4測定
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
將泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)行色譜分析（標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見附錄a中圖a.1）。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.4.2試樣溶液的測定
將試樣測定液進(jìn)行色譜分析，根據(jù)試樣峰面積從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的泛酸濃度。
6分析結(jié)果的表述
試樣中泛酸的含量按式（1）計算。
式中：
x——試樣中泛酸含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；
c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中泛酸的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μg/ml）；
v——試樣測定液總體積，單位為毫升（ml）；
f——試樣測定液稀釋倍數(shù)；
m——試樣的取樣量，單位為克（g）；
100/1 000——換算系數(shù)。
計算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
7精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
8其他
8.1對于固體試樣，當(dāng)稱樣量為5 g，定容至50 ml時，檢出限為0.025 mg/100 g，定量限為0.08 mg/100 g。
8.2對于液體試樣，當(dāng)取樣量為20 g，定容至50 ml時，檢出限為0.006 3 mg/ 100 g，定量限為0.02 mg/100 g。
第二法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
9原理
試樣經(jīng)酶解、提取、離心、過濾后，經(jīng)c18反相色譜柱分離，采用串聯(lián)質(zhì)譜多離子反應(yīng)監(jiān)測方式檢測，穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量。
10試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
10.1試劑
10.1.1乙睛（ch3cn）：色譜純。
10.1.2甲酸（hcooh）：色譜純。
10.1.3鹽酸（hcl）。
10.1.4冰乙酸（c2h4o2）。
10.1.5乙酸鋅[zn（ch3coo）2]。
10.1.6亞鐵氰化鉀[k4fe（cn）6]。
10.1.7三羥甲基氨基甲烷（c4h11no3）。
10.1.8碳酸氫鈉（nahco3）。
10.1.9碳酸氫鉀（khco3）。
10.1.10甲苯（c7h8）。
10.1.11 a-淀粉酶：酶活力≥1.5 u/mg。
10.1.12陰離子交換樹脂：dowex 1×8粒度38μm~75μm。
10.1.13堿性磷酸酶：來源于牛腸粘膜，ec 3.1.3.1，酶活力≥10 u/mg。
10.1.14鴿子肝臟丙酮提取物干粉：酶活力≥0.1 u/g。
10.2試劑配制
10.2.1甲酸溶液（0.1%）：吸取1 ml甲酸，用水稀釋至1 000 ml，混勻。
10.2.2乙酸鋅溶液（300 g/l）：稱取30.0 g乙酸鋅，用水溶解并稀釋至100 ml。
10.2.3亞鐵氰化鉀溶液（150 g/l）：稱取15.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至100 ml。
10.2.4 tris緩沖液：稱取121.0 g三羥甲基氨基甲烷溶于500 ml水中，用冰乙酸調(diào)ph至8.1±0.2，加水稀釋至1 000 ml，混勻，貯存于2℃~8℃冰箱中。
10.2.5碳酸氫鈉溶液（0.1 mol/l）：稱取0.84 g碳酸氫鈉，加水溶解并稀釋至100 ml，混勻。
10.2.6堿性磷酸酶溶液：稱取0.2 g堿性磷酸酶至研缽中，少量多次加水研磨至溶解，用水稀釋至10 ml。臨用現(xiàn)配，存于2℃~8℃冰箱預(yù)冷。
10.2.7鹽酸溶液（1 mol/l）：吸取83 ml鹽酸到800 ml水中，加水稀釋至1 000 ml，混勻。
10.2.8碳酸氫鉀溶液（0.02 mol/l）：稱取2 g碳酸氫鉀，加水溶解并稀釋至1 000 ml，混勻。
10.2.9樹脂活化：稱取100g陰離子交換樹脂于2 l錐形瓶中，加入1 l 1 mol/l鹽酸溶液，置于振蕩器上充分振搖10min，用鋪有濾紙的布氏漏斗過濾。將陰離子交換樹脂轉(zhuǎn)回錐形瓶，再加入1l 1mol/l鹽酸溶液重復(fù)振搖10 min、過濾。向陰離子交換樹脂加入1 l水振搖洗滌10 min，過濾，重復(fù)用水洗滌10次，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中。向陰離子交換樹脂加入少量水，混勻，逐滴向陰離子交換樹脂加入tris緩沖液，調(diào)節(jié)ph至8.0±0.1。置于2℃~8℃冰箱保存，2d內(nèi)使用。
10.2.10鴿子肝臟提取液：配制此試劑前- -天將所用容器放入2℃~8℃冰箱中冷藏過夜。稱取30 g鴿子肝臟丙酮提取物干粉，放入預(yù)冷的研缽中，冰浴條件下分次加入0.02mol/l碳酸氫鉀溶液300ml，研磨成勻質(zhì)混懸液。將混懸液轉(zhuǎn)至預(yù)冷的具蓋離心管中，蓋緊后充分振搖后，放入-20℃冰箱內(nèi)靜置10 min。取出后，3 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)至500 ml預(yù)冷的廣口瓶中。向上清液中加入部分活化樹脂（約150 g），放入冰水浴中振搖5 min。倒入預(yù)冷離心管中3 000 r/min離心5 min。將上清液移入另一500 ml預(yù)冷的廣口瓶中，-20℃靜置10 min。再加入剩余活化樹脂（約150 g），放入冰浴中振搖5 min，倒入離心管中，3 000 r/min離心5 min。收集上清液，-20℃靜置10 min，分裝于預(yù)冷的具塞試管中，-20℃冷凍保存，可保存1年。用前預(yù)置于2℃~8℃冰箱內(nèi)化凍并使用。
10.3標(biāo)準(zhǔn)品
10.3.1 d-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（c18h32can2o10，cas號：137-08-6）：純度≥99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)品。
10.3.213c6,15n2-泛酸鈣（13c6c12h32ca15n2o10，cas號：356786-94-2）：純度≥97%。
10.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
10.4.1泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500μg/ ml）：準(zhǔn)確稱取136 mg d-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg），加水溶解并轉(zhuǎn)入到250 ml容量瓶中，稀釋至刻度，混勻。標(biāo)準(zhǔn)儲備液-18℃及以下避光保存，可保存3個月。
10.4.2泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10μg/ml）：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液1ml于50ml容量瓶中，加水稀釋至刻度。臨用現(xiàn)配。
10.4.3內(nèi)標(biāo)儲備液（50μg/ml）：稱取5 mg13c6,15n2-泛酸鈣，加水溶解并轉(zhuǎn)入到100 ml容量瓶中，稀釋至刻度。內(nèi)標(biāo)儲備液- 18℃及以下避光保存，可保存6個月。
10.4.4泛酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：吸取適量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于25 ml容量瓶中，加入100μl內(nèi)標(biāo)儲備液，用水稀釋至25 ml，得到泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、300 ng/ml、600 ng/ml、1 000 ng/ml和1 500 ng/ml。臨用現(xiàn)配。
11儀器和設(shè)備
11.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（esi）。
11.2分析天平：感量分別為0.1 mg和0.01 g。
11.3 ph計：精度為±0.01。
11.4離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥8 000 r/ min。
11.5超聲波振蕩器。
11.6壓力蒸汽消毒器：121℃。
11.7恒溫振蕩水浴箱：振蕩頻率100 r/min±20 r/min。
11.8渦旋混合器。
12分析步驟
12.1樣品前處理
12.1.1谷薯類、肉蛋類、蔬果類、菌藻類、豆及堅(jiān)果類等食品
準(zhǔn)確稱取適量試樣（含0.02 mg~0.2 mg泛酸，精確到0.01 g），轉(zhuǎn)入至100 ml錐形瓶中。加入10 ml tris緩沖液、30 ml水，振蕩混勻。于121℃高壓條件下水解20 min。冷卻至室溫，依次加入0.1 ml碳酸氫鈉溶液、0.4 ml堿性磷酸酶溶液、0.2 ml鴿子肝臟提取液，混勻后，加100μl甲苯，具塞。37℃±1℃下以100 r/min±20 r/min振幅恒溫振蕩8 h~10h。轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，加水至刻度，過濾。
移取10.0 ml上述液體于50 ml離心管中，加入100μl內(nèi)標(biāo)儲備液，加水至20 ml，渦旋10s。分別加入0.4 ml乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液，加水至25 ml，渦旋10 s。靜置10 min~30 min后，8 000 r/min離心2 min。上清液過0.22μm尼龍濾膜后進(jìn)樣分析。
12.1.2嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、乳制品、飲料、營養(yǎng)素補(bǔ)充劑、果凍準(zhǔn)確稱取5 g固體試樣（精確到0.01 g），加水至50 g（精確到0.01 g）。加入a-淀粉酶0.2 g，振搖混勻，蓋上瓶塞，在55℃±5℃水浴條件下振搖酶解30 min。稱取0.5 g~5.0 g上述液體（精確到0.1 mg），置于50 ml離心管中。液體試樣混勻后直接稱取0.5 g~5.0 g（精確到0.1 mg），置于50 ml離心管中。
加入100μl內(nèi)標(biāo)儲備液，加水至20ml，渦旋10s。分別加入0.4ml乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液，加水至25 ml，渦旋10 s。靜置10 min~30 min后，8 000 r/min離心2 min。上清液過0.22μm尼龍濾膜后進(jìn)樣分析。
12.2儀器參考條件
12.2.1液相參考色譜條件
液相參考色譜條件如下：
a）色譜柱：c18，1.8μm，100 mm×2.1 mm，或相當(dāng)者。
b）柱溫：35℃。
c）流速：0.3 ml/min。
d）進(jìn)樣量：2μl。
e）流動相：a相為0.1%甲酸溶液，b相為乙腈。液相色譜梯度洗脫條件見表1。
12.2.2質(zhì)譜參考條件
質(zhì)譜參考條件如下：
a）電離方式：esi+。
b）毛細(xì)管電壓：3.0 kv。
c）干燥氣溫度：400℃。
d）干燥氣流速：800 l/h。
e）錐孔反吹氣流速：150 l/h。
f）碰撞氣為高純氬。
g）六通閥：0min~2min流動相進(jìn)廢液，2min~7min流動相進(jìn)質(zhì)譜。
h）監(jiān)測方式：mrm，多反應(yīng)監(jiān)測。
i）監(jiān)測離子對、碰撞能量參考條件見表2。
12.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定相應(yīng)的泛酸與c。，i5n2-泛酸鈣的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中泛酸的濃度為橫坐標(biāo)，以泛酸的響應(yīng)值與13c6，15n2-泛酸鈣的響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖參見附錄a中圖a.2。
12.4試樣溶液的測定
將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到泛酸的響應(yīng)值與13c6，15n2-泛酸鈣的響應(yīng)值的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中泛酸的濃度。
12.5定性測定
在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測定時，如果檢出的色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)，并且在樣品質(zhì)譜圖中所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度比相對偏差不超過表3規(guī)定的范圍。
13分析結(jié)果的表述
試樣中泛酸的含量按式（2）計算。
式中：
x——試樣中泛酸的含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；
——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中泛酸的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v——試樣測定液體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的取樣量，單位為克（g）；
100/106——換算系數(shù)；
f——稀釋因子。
計算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
14精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
15其他
15.1對于固態(tài)試樣，當(dāng)取樣量為5 g，定容至25 ml時，本方法檢出限為0.025 mg/100 g，定量限為0.05 mg/100 g。
15.2對于液體試樣，當(dāng)取樣量為5 g，定容至25 ml時，本方法檢出限為0.002 5 mg/100 g，定量限為0.005 mg/100 g。
第三法微生物法
16原理
泛酸是植物乳植桿菌（lactiplantibacillus plantarum）生長所必需的營養(yǎng)素，在一定可控的條件下培養(yǎng)一段時間后，植物乳植桿菌的生長與泛酸含量呈現(xiàn)一定線性關(guān)系。因植物乳植桿菌生長導(dǎo)致的培養(yǎng)液渾濁度的變化可采用分光光度計或酶標(biāo)儀進(jìn)行透光率（或吸光度值）測定，根據(jù)培養(yǎng)液中泛酸含量與透光率（或吸光度值）擬合曲線方程計算出試樣中泛酸的含量。
17試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t6682規(guī)定的一-級水。
17.1試劑
17.1.1鹽酸（hci）。
17.1.2冰乙酸（c2h4o2）。
17.1.3氫氧化鈉（naoh）。
17.1.4氯化鈉（nacl）。
17.1.5碳酸氫鈉（nahco3）。
17.1.6碳酸氫鉀（khco3）。
17.1.7三水合乙酸鈉（c2h3o2na·3h2o）。
17.1.8三羥甲基氨基甲烷（c4h11no3）。
17.1.9甲苯（c7h8）。
17.1.10陰離子交換樹脂dowex 1×8：粒度38μm~75μm。
17.1.11 a-淀粉酶：酶活力≥1.5 u/mg。
17.1.12木瓜蛋白酶：酶活≥10 u/mg。
17.1.13堿性磷酸酶：來源于牛腸黏膜，ec 3.1.3.1，酶活力≥10 u/mg。
17.1.14鴿子肝臟丙酮提取物干粉：酶活力≥0.1 u/g。
17.2試劑配制
17.2.1生理鹽水：稱取9.0 g氯化鈉，加水溶解并稀釋至1 0000 ml，混勻。臨用前于121℃高壓滅菌10 min，備用。
17.2.2鹽酸溶液：吸取100 ml鹽酸與50倍水混合。
17.2.3乙酸溶液（0.2 mol/l）：吸取1.2 ml冰乙酸，用水稀釋至100 ml，混勻。
17.2.4乙酸鈉溶液（0.2 mol/l）：稱取2.7 g三水合乙酸鈉，加水溶解并稀釋至100 ml，混勻。
17.2.5氫氧化鈉溶液（2 mol/l）：稱取8 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至100 ml，混勻。
17.2.6乙酸緩沖液（1.0 mol/l，ph3.8）：吸取58 ml冰乙酸加入800 ml水中，用2 mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至3.8±0.1，加水至1 000 ml，混勻。
17.2.7乙酸緩沖液（1.0 mol/l，ph 4.5）：吸取58 ml冰乙酸加入800 ml水中，用2 mo/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至4.5±0.1，加水至1 000 ml，混勻。
17.2.8 tris緩沖液：同10.2.4。
17.2.9碳酸氫鈉溶液（0.1 mol/l）：同10.2.5。
17.2.10堿性磷酸酶溶液：同10.2.6。
17.2.11鴿子肝臟提取液：同10.2.10。
17.3培養(yǎng)基
17.3.1乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄b中b.1。
17.3.2泛酸測定用培養(yǎng)液：見附錄b中b.2。
17.4培養(yǎng)液的配制
見附錄b。
17.5標(biāo)準(zhǔn)品
d-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（c18h32ca2n2o10，cas號：137-08-6）：純度≥99%，或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)品。
17.6標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
17.6.1泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（400μg/ml）：精確稱取435 mg d-泛酸鈣（精確至0.1 mg），加水溶解并轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，加10ml 0.2mol/l乙酸溶液、100ml 0.2mol/l乙酸鈉溶液，用水定容至刻度。貯存于棕色瓶中，加入200μl甲苯，于2℃~4℃冰箱中可保存2年。
17.6.2泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.00μg/ml）：準(zhǔn)確吸取2.5 ml泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于1 000 ml容量瓶中，加入10 ml 0.2 mol/l乙酸溶液、100 ml 0.2 mol/l乙酸鈉溶液用水定容至刻度。加入200μl甲苯，于2℃~8℃冰箱中可保存1年。
17.6.3泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（20.0 ng/ml）：準(zhǔn)確吸取2.00 ml泛酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于100 ml容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。臨用現(xiàn)配。
18儀器和設(shè)備
18.1天平：感量0.1 mg。
18.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。
18.3恒溫振蕩水浴箱：37℃±1℃，振蕩頻率100 r/ min±20 r/min。
18.4壓力蒸汽消毒器：121℃。
18.5渦旋振蕩器。
18.6離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥3 000 r/min。
18.7 ph計：精度為±0.01。
18.8可見分光光度計。
18.9酶標(biāo)儀。
18.10超聲波振蕩器。
18.11微孔板（無菌）：0.36 ml，1.1 ml。
注：所有測試試管使用前洗刷干凈，沸水浴30 min，瀝干后放入鹽酸溶液中沒泡2 h，經(jīng)水沖洗后，經(jīng)170℃±2℃烘干3 h后使用。
19菌種的制備與保存
19.1菌種
植物乳植桿菌lactiplantibacillus plantarum（atcc 8014），或等效菌株。
19.2儲備菌株的制備
無菌操作條件下將菌種植物乳植桿菌-凍干菌粉轉(zhuǎn)接至無菌乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中，36℃±1℃恒溫培養(yǎng)20 h~24 h，使菌種復(fù)活。連續(xù)傳種2次~3次，將培養(yǎng)好的瓊脂管作為植物乳植桿菌儲備菌株，放入2℃~4℃冰箱中保存。
19.3菌株傳代與保存
將植物乳植桿菌儲備菌株每月至少傳代1次，培養(yǎng)并保存新菌株。
19.4菌株活化
試驗(yàn)前2 d~3 d，將最新保存的菌株接種至無菌瓊脂管中，36℃±1℃培養(yǎng)20 h~24 h，以活化菌株，用于接種液的制備。
注：如果新菌株保存時間超過2周，試驗(yàn)前宜連續(xù)傳種2代~3代以保證細(xì)菌活力。
19.5接種液的制備
試驗(yàn)前一天，取2 ml泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（20 ng/ml）和4 ml泛酸測定用培養(yǎng)液混勻，分裝于2支5 ml離心管中，塞好棉塞，121℃下高壓滅菌15 min，冷卻至室溫，此即種子培養(yǎng)液。
用接種環(huán)將活化菌株接種至種子培養(yǎng)液中，36℃±1℃培養(yǎng)20 h~24h。取出離心管，3000 r/min離心10min，棄去上清液。無菌操作下加入約3ml已預(yù)先無菌化處理的生理鹽水，振蕩洗滌沉淀，3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用生理鹽水重復(fù)洗滌一次，再加入約3 ml無菌生理鹽水，振蕩混勻，制成接種液，立即使用。
注：為保證接種液中菌群數(shù)量，可另外制備1支種子培養(yǎng)液，同法接種、洗滌，加入生理鹽水混勻；以生理鹽水為對照，用分光光度計在550nm波長下測定混懸液透光率。根據(jù)此管透光率調(diào)整接種液體積，使透光率在60%~80%范圍內(nèi)。
20分析步驟
注：所有操作避免日光紫外線直射。
20.1試樣制備
谷薯類、豆類、乳粉等試樣需粉碎、研磨、過篩（篩板孔徑0.3 mm~0.5 mm）；肉、蛋、堅(jiān)果等用勻質(zhì)器制成食糜；果蔬、半固體食品等用勻漿器混勻；液體試樣用前振搖混勻。4℃冰箱可保存1周，-20℃冰箱可保存半年。試樣勻質(zhì)化處理過程中可加入適量水，并稱量加水前后試樣質(zhì)量，計算質(zhì)量換算因子。
20.2試樣提取
20.2.1酶解法
谷薯類、肉蛋類、蔬果類、菌藻類、豆及堅(jiān)果類等食品試樣中的泛酸含量應(yīng)采用酶解法。
水解：準(zhǔn)確稱取適量試樣（m），精確至0.001 g，一般固態(tài)及半固態(tài)谷薯類、肉類、蛋類、豆類、菌藻類及其制品稱取1 g~5 g，新鮮水果、蔬菜等含水量較高的食品稱取5 g~10 g，稱樣量可根據(jù)試樣泛酸含量進(jìn)行調(diào)整。轉(zhuǎn)入至100 ml錐形瓶中，加10 ml tris緩沖液、30 ml水，振蕩混勻，于121℃高壓條件下水解15 min~20 min.
酶解：冷卻至室溫，依次加入0.1 ml碳酸氫鈉溶液、0.4 ml堿性磷酸酶溶液、0.2 ml鴿子肝臟提取液，小心混勻，如果試樣中淀粉含量較高，導(dǎo)致樣液較為黏稠，可另外加入20mg~40mg a-淀粉酶。加50μl甲苯，具塞，37℃±1℃下以80 r/min±20 r/min振幅振蕩水浴8 h~10 h。
定容、沉淀、過濾：將試樣酶解液轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，用水定容至刻度（v），過濾。準(zhǔn)確吸取適量濾液（1.0 ml~10.0 ml，v1）至25 ml具塞刻度試管底部，加水至15 ml。如果濾液澄清且滴加冰乙酸沒有沉淀出現(xiàn)，用1.0 mol/l乙酸緩沖液直接調(diào)節(jié)ph至6.8±0.2，用水定容至25 ml（v2）；如果濾液渾濁或滴加冰乙酸有沉淀析出，則用冰乙酸調(diào)節(jié)ph至4.5±0.1，加水定容至25 ml（v2），過濾后準(zhǔn)確吸取適量濾液（5.0 ml~10.0 ml，v3）至另一25 ml具塞刻度試管，用tris緩沖液或稀的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.8±0.2，用水定容至25 ml（v4）。
另取一試管按試樣提取步驟加入緩沖液、碳酸氫鈉溶液、堿性磷酸酶溶液、鴿子肝臟提取液，a-淀粉酶（使用時），振蕩水浴后調(diào)節(jié)ph后定容過濾，作為酶空白液。
20.2.2直接提取法
嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、乳制品、飲料、營養(yǎng)素補(bǔ)充劑、果凍應(yīng)采用直接提取法。
準(zhǔn)確稱取適量試樣（m），精確至0.001 g，一般固體試樣0.2 g~2 g、液態(tài)試樣1 g~10g或1 ml~10 ml，轉(zhuǎn)入100 ml錐形瓶中，加入10 ml乙酸緩沖液（1.0 mol/l，ph 4.5），30 ml水，于121℃高壓條件下水解15 min~20 min，冷卻至室溫。轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用水定容至刻度（v），混勻后過濾。
注：如果試樣液較為渾濁，加入50mgr淀粉酶、100mg木瓜蛋白酶，于40℃±2℃水浴中振蕩30min混勻后再定容過濾。
20.3稀釋
根據(jù)試樣液中泛酸含量，用水對試樣提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋（f），試樣稀釋液中泛酸濃度為2.0ng/ml~ 4.0 ng/ml。
20.4測定
20.4.1試管法
20.4.1.1測定系列管制備
所用試管使用前洗刷干凈，用水蒸煮30 min，瀝干后放入鹽酸溶液中浸泡2 h，取出用水沖洗后經(jīng)170℃烘干3 h后使用。
取4支試管按表4制備試樣或酶空白系列管。四參數(shù)曲線擬合。
20.4.1.2接種和培養(yǎng)
向所有測定系列管加入5 ml培養(yǎng)基，蓋好塞子（棉塞、塑料膠塞或不銹鋼塞），121℃下高壓滅菌15 min。
待測定系列管冷卻至室溫后，在無菌操作條件下向每支測定管加入50μl接種液。塞好棉塞，充分混勻后，置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 h~24 h。另準(zhǔn)備一支標(biāo)準(zhǔn)0管不接種，作為0對照管。
20.4.1.3測定
將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣和酶空白系列管用漩渦混勻器混勻。用厚度1cm比色杯，于550nm處調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)0管透光率為100%（或吸光度值為0），依次測定標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣和酶空白系列管的透光率（或吸光度值）。
注：適宜泛酸測定的光譜范圍為540nm~660nm。有以下任一情形終止測定：接種的0對照管有明顯的細(xì)菌增長；與0對照管相比，標(biāo)準(zhǔn)0管透光率<80%或吸光度值>0.3；與標(biāo)準(zhǔn)0管相比，標(biāo)準(zhǔn)系列管透光率最大變化量<40%或吸光度值變化量<0.4。
20.4.2微孔板法
20.4.2.1無菌處理
先將試樣提取液、標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、泛酸測定用培養(yǎng)液及水進(jìn)行無菌化處理，121℃下高壓滅菌15min，或無菌操作下用無菌濾膜（0.22μm）過濾除菌。
20.4.2.2待測系列管制備
取無菌1.1 ml深孔板，按表6、表7配制試樣和酶空白系列管、標(biāo)準(zhǔn)系列管，覆膜，振搖混勻。注意消除微孔表面氣泡。
20.4.2.3接種和培養(yǎng)
取滅菌泛酸測定用培養(yǎng)液，每10 ml加入40μl接種液，混勻。
取0.36 ml無菌微孔板，加入150μl標(biāo)準(zhǔn)系列管（2套~3套）、試樣和酶空白系列管溶液。每個微孔再加入150μl已接種的泛酸測定培養(yǎng)液，覆膜，水平搖勻，置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h~24 h。
20.4.2.4測定
水平振搖混勻微孔板中培養(yǎng)液，撕膜，消除微孔表面氣泡，用酶標(biāo)儀在550nm處讀取吸光度值。
注1：適宜泛酸測定的光譜范圍及終止測定的判斷標(biāo)準(zhǔn)同試管法。
注2：也可使用與本標(biāo)準(zhǔn)檢測原理相同且經(jīng)等效驗(yàn)證的泛酸檢測試劑盒。
21分析結(jié)果表述
21.1標(biāo)準(zhǔn)曲線
以標(biāo)準(zhǔn)系列管中泛酸濃度為橫坐標(biāo)，以每個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)透光率（或吸光度值）均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合四參數(shù)曲線方程。
21.2試樣結(jié)果計算
根據(jù)試樣和酶空白系列管的透光率（或吸光度值），從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到對應(yīng)的泛酸濃度（cx），按照式（3）計算試樣稀釋液中泛酸濃度（c）。如果試樣系列管中有3支以上在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，且換算為試樣稀釋液泛酸濃度的相對偏差≤15%，計為有效管。根據(jù)有效管個數(shù)按照式（4）計算泛酸稀釋液質(zhì)量濃度平均值（2），并繼續(xù)按照式（5）或式（6）計算試樣中泛酸含量結(jié)果。
試樣稀釋液中泛酸質(zhì)量濃度及其平均值按式（3）、式（4）計算。
式中：
ci——試樣稀釋液泛酸質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
cx——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的試樣系列管中泛酸質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v5/vx——-制備試樣系列管時最終體積與吸取的試樣稀釋液體積之比；
`c——試樣稀釋液泛酸質(zhì)量濃度均值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
——由有效管計算的試樣稀釋液質(zhì)量濃度和，單位為納克每毫升（ng/ml）；
n——有效管個數(shù)。
采用直接提取法的試樣按式（5）計算泛酸含量。
式中：
x——試樣中泛酸含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；
`c——試樣稀釋液泛酸質(zhì)量濃度均值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v——試樣提取液定容體積，單位為毫升（ml）；
f——試樣提取液稀釋倍數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；
100——換算系數(shù)。
采用酶解法提取的試樣，按式（6）計算泛酸含量。
式中：
x——試樣中泛酸含量，單位為毫克每百克（mg/100 g）；
`c——試樣稀釋液中泛酸質(zhì)量濃度均值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
`c0——酶空白液中泛酸質(zhì)量濃度均值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v——試樣提取液的定容體積，單位為毫升（ml）；
v2、v4——調(diào)節(jié)ph后定容體積，單位為毫升（ml）；
v1、v3——調(diào)節(jié)ph時吸取的試樣提取液體積，單位為毫升（ml）；
f——試樣提取液稀釋倍數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；
100/106——換算系數(shù)。
結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
22精密度
一般食品在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%；營養(yǎng)素補(bǔ)充劑和強(qiáng)化食品在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
23其他
23.1酶解法提?。悍Q樣量為5 g時，檢出限為0.025 mg/100 g，定量限為0.05 mg/100 g。
23.2直接提取法：固體稱樣量為2 g時，檢出限為0.025 mg /100 g，定量限0.05 mg/100 g；液體稱樣量為10 g時，檢出限為0.01 mg /100 g，定量限為0.02 mg/100 g。