小鼠腸微血管細胞試劑盒的應用！
一、背景
小鼠腸微血管細胞試劑盒適合于培養(yǎng)小鼠的腸微血管細胞。
本試劑盒包含：
（1）optitdstm小鼠腸微血管細胞組織解離液
（2）小鼠腸微血管細胞組織處理緩沖液
（3）fibrouttm小鼠腸微血管細胞成纖維抑制劑
（4）小鼠腸微血管組織洗液
（5）小鼠腸微血管細胞生長因子及血清
（6）小鼠腸微血管細胞基礎培養(yǎng)基
（7）小鼠腸微血管組織預備液。
微血管是指心血管系統(tǒng)的微細血管，它們在顯微鏡下才能見到。微血管指通連小動脈和小靜脈間的細小血管，分布于各種組織和器官中，分支通連成網(wǎng)，故也稱終末血管床。小鼠腸微血管細胞可以保持原代細胞的分化狀態(tài)，進而可以用于評估體外藥物模型系統(tǒng)和調(diào)節(jié)特定基因的遺傳功能。雖然腸微血管組織機械韌性很強，但利用小鼠腸微血管細胞試劑盒中提供的腸微血管組織分離體系來分離，edta/egta處理過的腸微血管組織能使得腸微血管組織中微血管細胞的一些功能特性發(fā)生改變，從而將腸微血管細胞分離開來。
二、應用
用于巨噬細胞金屬彈力酶基因轉(zhuǎn)染ct-26細胞對小鼠原位結(jié)腸癌生長及微血管生成的影響
巨噬細胞金屬彈力酶(mouse macrophage metalloelastase,mme)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,mmp)家族成員之一,也稱mmp-12。與其它mmp成員不同,mme可以分解纖溶酶原,產(chǎn)生具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖作用的血管抑素(angiostatin),進而抑制體內(nèi)腫瘤細胞的生長,在抗腫瘤血管生成中具有重要作用。方法pcr擴增編碼mme基因結(jié)構(gòu)域ⅰ和ⅱ的cdna片段,克隆入pgem-t載體中,限制性內(nèi)切酶、dna序列分析鑒定目的基因后,定向亞克隆到真核細胞表達載體pcdna3.1(+)中,并進行雙酶切及pcr鑒定。再將構(gòu)建的真核細胞表達載體pcdna3.1-mme穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠ct-26結(jié)腸癌細胞。采用rt-pcr、免疫細胞化學和western blot方法,鑒定mme mrna和重組蛋白在ct-26細胞中的表達。
采用體外分解ⅰ型膠原蛋白和明膠酶譜方法,鑒定mme重組蛋白的酶活性。建立mme轉(zhuǎn)染組及對照組小鼠原位結(jié)腸癌種植模型,觀察mme對原發(fā)性結(jié)腸癌生長的影響,采用免疫組織化學、原位雜交及western blot方法檢測腫瘤組織中微血管密度(microvessel density,mvd)和vegf的表達。結(jié)果以重組質(zhì)粒puc9-mme cdna為模板進行pcr擴增,pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后,在1%瓊脂糖凝膠電泳中可見一條清晰的條帶,位于750bp和1000bp之間,與預期的840bp目的基因片段長度相符。pgem-t-mme用bamhi和xbai雙酶切,產(chǎn)生2個大小分別為3.0kb和832bp左右的條帶,與預期結(jié)果基本一致。pgem-t-mme核苷酸序列正向測序和反向測序結(jié)果表明,與小鼠mme cdna序列的堿基符合率為99.63%。
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