細(xì)胞凍存是又是最復(fù)雜的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)單是因?yàn)槌跞腴T(mén)的生物學(xué)小白也懂得如何凍存細(xì)胞；而復(fù)雜是因?yàn)?，一個(gè)細(xì)胞凍存方案，是個(gè)國(guó)際性難題——如何優(yōu)化冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant cpa),如何科學(xué)優(yōu)化凍存曲線(xiàn)，保證一個(gè)好的復(fù)蘇活率，這是個(gè)仰之彌高，鉆之彌堅(jiān)的問(wèn)題。
低溫生物學(xué)領(lǐng)域最著名的，莫過(guò)于mazur雙因素假說(shuō)——水冰相變
根據(jù)mazur兩因素假說(shuō)，細(xì)胞在凍存過(guò)程中，如果降溫太慢，就會(huì)發(fā)生不可逆的損傷性脫水，例如線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在結(jié)構(gòu)上受損。如果冷卻太快，細(xì)胞沒(méi)有足夠的時(shí)間來(lái)達(dá)到最佳脫水狀態(tài)，剩余的細(xì)胞內(nèi)水會(huì)形成冰，這也是有害的，會(huì)損害細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)。
applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics
mazur雙因素假說(shuō)符合多年來(lái)實(shí)際觀(guān)察到的結(jié)果。這就是經(jīng)常被引用的“-1℃/min冷卻速率”的起源 “-1℃”并不是一個(gè)神秘的數(shù)字，而是反映了在低溫保存過(guò)程中，細(xì)胞達(dá)到最佳脫水狀態(tài)所需的時(shí)間。這是在冷卻細(xì)胞時(shí)生物質(zhì)本身的安全冷卻動(dòng)力學(xué)，而不僅僅是冷凍設(shè)備的控制參數(shù)。
沖擊冷卻，誘導(dǎo)冰核產(chǎn)生
當(dāng)液體冷卻時(shí)，只有當(dāng)溫度降至溶液的平衡冰點(diǎn)以下時(shí)才能發(fā)生成核，在冰成核過(guò)程中，液體分子相互碰撞、聚集并形成團(tuán)簇。這是一個(gè)隨機(jī)發(fā)生的過(guò)程。通過(guò)在低溫冷卻器中快速冷卻約2分鐘，引入簡(jiǎn)短的“沖擊冷卻”步驟，也可以誘導(dǎo)冰核產(chǎn)生。冰成核是相變的一部分，冰晶的形成是一種放熱相變，向環(huán)境釋放熱量，使樣品瞬間升溫。此時(shí)需要引入一個(gè)保持時(shí)間（大約10分鐘，取決于樣本），以允許冷卻控制的潛熱消散。
walking on thin ice: controlled freezing & thawing of pharmaceutical active molecules
凍存保護(hù)劑的影響
kymriah和yescarta (fda批準(zhǔn)的前兩種cart細(xì)胞藥物)分別使用7.5%和5%的dmso進(jìn)行低溫保存，在冷凍保存溶液中添加類(lèi)似的糖和/或大分子。二甲基亞砜(dmso)，被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”冷凍保護(hù)劑(cpa)，用于冷凍保存幾乎所有有治療意義的細(xì)胞(紅細(xì)胞除外)。dmso在長(zhǎng)期暴露和輸注期間具有高度的細(xì)胞毒性，可在高達(dá)50%的患者中引起輕微不良反應(yīng)，以及更罕見(jiàn)但更嚴(yán)重的心血管、神經(jīng)或呼吸問(wèn)題。
一些cpa(如二甲基亞砜或甘油)會(huì)穿過(guò)細(xì)胞膜并提供細(xì)胞內(nèi)保護(hù)，而其他一些制劑，如糖或聚合物，雖然細(xì)胞內(nèi)滲透很少，依然可以在細(xì)胞系統(tǒng)中提供cpa效應(yīng)，這歸因于它們產(chǎn)生部分脫水和限制細(xì)胞內(nèi)有害冰晶的形成。
這是一個(gè)“經(jīng)驗(yàn)法則”，幾乎所有有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在冷凍保存期間都需要細(xì)胞內(nèi)保護(hù);非滲透性cpa可以為調(diào)節(jié)細(xì)胞外環(huán)境中的冰晶生長(zhǎng)(從而有助于減輕冰形成的滲透效應(yīng))。大分子聚合物，不進(jìn)入細(xì)胞，直接保護(hù)細(xì)胞膜，誘導(dǎo)在細(xì)胞外形成玻璃化的溶液。
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不同的包材類(lèi)型對(duì)程序性降溫過(guò)程的顯著影響
development of a reliable, low-cost, controlled cooling rate instrument for the cryopreservation of hematopoietic stem cells
一套穩(wěn)定成熟的程序降溫方式，可以有效維持細(xì)胞活性，滿(mǎn)足細(xì)胞高質(zhì)量?jī)龃嫘枨?，保證細(xì)胞凍存環(huán)節(jié)的安全性，合規(guī)性。一臺(tái)安全可靠的程序性降溫儀，是至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。它可以提供沖擊冷卻，控制冰核生成，保證一度每分鐘的降溫速率，均一化標(biāo)準(zhǔn)化地冷凍大批量的樣本。
程序性降溫主要是通過(guò)微處理器控制系統(tǒng)和電磁閥，通過(guò)控制噴入腔體中的液氮量來(lái)精確控制降溫速率。其優(yōu)點(diǎn)是：控溫精確，受外界環(huán)境影響小。尤其是處理大體積樣本時(shí)，快速?lài)娙氲拇罅恳旱讕ё邩颖局械臐摕?，從而快速降溫，保證更好的樣本復(fù)蘇活性。
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可提供完善的六套預(yù)設(shè)程序，同時(shí)提供無(wú)限的程序編輯能力，更精確的溫度控制系統(tǒng)，符合21crf part11的合規(guī)要求、不同容量型號(hào)滿(mǎn)足細(xì)胞研究各階段冷凍能力需求，降低凍存成本，確保流程一致性。
biolife solutions程序控制降溫儀提供配套電腦及軟件，操作簡(jiǎn)單，實(shí)時(shí)溫控曲線(xiàn)呈現(xiàn)，模板方案調(diào)用查詢(xún)方便，合規(guī)數(shù)據(jù)報(bào)告導(dǎo)出等，為優(yōu)化程序性降溫流程提供解決方案。
程序降溫儀可以提供精確的溫度控制，確保樣本在冷凍過(guò)程中溫度的均一性及良好的批間一致性。這對(duì)于細(xì)胞、組織和其他生物樣本的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和活率保持非常重要。而現(xiàn)在我們提供了整體凍存的解決方案從28l-67l-781l，獲得準(zhǔn)確的溫度控制，達(dá)到小規(guī)模試驗(yàn)到gmp生產(chǎn)級(jí)別的工藝連貫性。