《中國植物志》第四十九卷第三分冊(cè)記載，山茶科植物約有36屬、700種，我國有15屬、480余種。廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)，是華南地區(qū)常綠闊葉林的建群種，其中不乏高價(jià)值的經(jīng)濟(jì)樹種。如原產(chǎn)我國的茶樹(camelliasinensis)，其嫩葉可制茶葉;油茶(c.oleifera)富含油脂，可榨茶油，供食用和工業(yè)用;山茶(c.japonica)和茶梅(c.sasanqua)花大而艷麗，是世界著名的木本花卉植物。山茶科還有許多珍稀瀕危植物，如金花茶(c.nitidissima)是我國～級(jí)保護(hù)植物，有“植物大熊貓“之稱。山茶科中有很多植物為國家級(jí)珍稀植物，如豬血木(euryodendronexcelsum)、圓籽荷(apterospermaobla—ta)和杜鵑紅山茶(camelliachangii)等，其中豬血木和圓籽荷為單種屬植物，已被列為國家二級(jí)保護(hù)植物。將植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于山茶科植物的快速繁殖，對(duì)保護(hù)山茶科樹種的種質(zhì)資源，豐富園林植物多樣性，緩解國內(nèi)優(yōu)質(zhì)木材和園林綠化植物供應(yīng)緊張的狀況，具有重要的意義。本文從山茶科植物組織培養(yǎng)外植體的選擇和分化途徑、基本培養(yǎng)基、激素及附加營養(yǎng)成分的使用等方面探討組織培養(yǎng)技術(shù)在山茶科植物中的研究現(xiàn)狀和實(shí)際應(yīng)用中存在的問題。
1山茶科植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)概況
山茶科野生植物大多生長(zhǎng)在深山老林，與世隔絕且生境范圍狹窄，性喜溫暖濕潤(rùn)氣候，栽培環(huán)境應(yīng)適當(dāng)遮陰并保持一定的濕度，避免強(qiáng)陽光長(zhǎng)時(shí)間直接照曬。由于它對(duì)栽培環(huán)境、土壤、水分及管理技術(shù)的要求比較高，加上資源稀少，應(yīng)用受到極大限制，也導(dǎo)致人們對(duì)它的研究熱情不高。我國所有的山茶科15個(gè)屬中，只有山茶屬、大頭茶屬、木荷屬3個(gè)屬有組織培養(yǎng)成功的報(bào)道，這3個(gè)屬中僅有茶樹和油茶的組織培養(yǎng)技術(shù)已趨于成熟.更多的尚在起步階段。到目前為止，組織培養(yǎng)已獲成功的山茶科植物有茶樹(c.sinensis)、油茶(c.oleifera)“、滇大頭茶(gordoniayunnanensis)、藪北茶(yabu—kita)、木荷(schimasuperba)和紅木荷(s.walli—chii)、金花茶(camelliachrysantha)(表1)。
2山茶科植物組織培養(yǎng)外植體選擇和分化途徑
2.1山茶科植物組織培養(yǎng)外植體的的選擇外植體的選擇是植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。外植體供體植株的年齡、發(fā)育階段、生長(zhǎng)環(huán)境和外植體取材部位不同可導(dǎo)致外植體生理狀態(tài)差異.從而影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生。山茶科植物組織培養(yǎng)采用的外植體種類較多，包括莖尖、種子、花蕾等。無論何種外植體，它們所處的發(fā)育狀態(tài)與來源均影響體胚發(fā)生，如切取茶樹種子無苗萌發(fā)的子葉、胚芽、胚軸與胚根切段外植體，幾種外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織的能力存在差異，只有胚軸、子葉、胚芽能產(chǎn)生胚性愈傷組織，其中以子葉和胚軸形成的愈傷組織生長(zhǎng)較快。
2.2山茶科植物組織培養(yǎng)的分化途徑通常細(xì)胞組織培養(yǎng)獲得再生植株有兩條途徑，一是器官發(fā)生途徑;二是體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)。從現(xiàn)有的報(bào)道來看，山茶科植物組織培養(yǎng)已獲成功的分化途徑有器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚、花藥發(fā)生途徑兩種。
器官發(fā)生包括由莖尖、腋芽、原球莖、球莖、塊莖、鱗莖等外植體直接分化成器官的直接發(fā)生和外植體先脫分化形成愈傷組織再分化成器官的間接發(fā)生兩種。此途徑中莖芽和根是在愈傷組織或外植體的不同部位分別獨(dú)立形成的。在直接器官發(fā)生途徑中，以芽或帶芽莖段為外植體直接誘導(dǎo)芽的萌發(fā)獲得再生植株的植物有藪北茶、滇大頭茶、龍井茶、油茶。在間接器官發(fā)生途徑中，以莖段或葉為外植體通過誘導(dǎo)愈傷組織，再誘導(dǎo)芽的再生的植物有滇大頭茶、油茶。
體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)是指雙倍體或單倍體的體細(xì)胞在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合，而通過與合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過程¨。杜克久等將云南大葉茶(camelliasinensisvar.as—samicakitamura)胚性細(xì)胞系中懸浮培養(yǎng)物繼代轉(zhuǎn)入附加0.05mg/l2，4一d和0.5mg/lba的改良ms液體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)28d后，誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生黃色、松散顆粒的愈傷組織，再轉(zhuǎn)入到液體分化培養(yǎng)基上(不附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其余同誘導(dǎo)培養(yǎng)基)培養(yǎng)28d，獲得了不同發(fā)育時(shí)期的體胚。
花藥培養(yǎng)是把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育分化成植株的過程。郭玉瓊等用鐵觀音的花蕾及花藥在含有0.5mg/l2，4一d的ms培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出了愈傷組織。
3山茶科植物組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基應(yīng)用于山茶科植物組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基主要有：ms、1/2ms、改良ms、er、mt，以ms培養(yǎng)基居多。楊國偉等報(bào)道，ms比heller、white培養(yǎng)基更利于茶樹愈傷組織的生長(zhǎng)，茶樹愈傷組織在ms培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率可達(dá)到90%從已有的報(bào)道來看，基本培養(yǎng)基中的大量元素對(duì)山茶科植物組織堵養(yǎng)影響很大，ms培養(yǎng)基大量元素減半，不僅有利于山茶科植物莖段的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)，而且有利于減少莖段的褐化，提高成活率。在實(shí)際應(yīng)用中，大多數(shù)學(xué)者在誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)時(shí)采用全量的大量元素，而在生根培養(yǎng)時(shí)采用半量的大量元素。在組織培養(yǎng)時(shí)，由于培養(yǎng)物的光合作用能力較弱，所以需要在培養(yǎng)基中添加一些糖類。一方面，糖作為碳源，為細(xì)胞的呼吸提供底物和能源;另一方面，在培養(yǎng)過程中，組織不斷從培養(yǎng)基中吸取糖，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，糖濃度不斷降低，不能維持正常的滲透壓;此外，適宜的糖濃度對(duì)器官的發(fā)生也有重要作用。山茶科植物組織培養(yǎng)所需的蔗糖濃度多在4%，而金花茶胚培養(yǎng)需要6%～8%。
4山茶科植物組織培養(yǎng)的激素及附加營養(yǎng)物植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，雖用量極小，但在組織培養(yǎng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。激素的種類和不同功能激素的配比是影響外植體能否成功啟動(dòng)的關(guān)鍵因素之一。對(duì)茶樹而言，各因素對(duì)龍井茶愈傷組織誘導(dǎo)的作用大小依次為：2，4一d>6一ba>naa。在山茶科植物愈傷組織或芽的誘導(dǎo)階段，大部分植物使用6一芐基腺嘌呤(6一ba)，濃度為0.5—4mg/lj。畢方鋮等在油茶試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在不同的6一ba濃度中，以30mg/l的誘導(dǎo)效果最好，芽的誘導(dǎo)率為73.33%，而在6一ba和naa組合中，以6一ba3.0mg/l+naa1.0mg/l為最佳濃度組合，誘導(dǎo)率最高，達(dá)83.33%。李建安等在廣寧紅花油茶和小果油茶的花藥培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，兩種油茶在ms+2，4一d0.6mg/l+naa0.4mg/l和b5+2，4一d1.2mg/l+6～ba0.4mg/l培養(yǎng)基中，廣寧紅花油茶誘導(dǎo)率高達(dá)94.67%和91.00%，小果油茶則分別為8.00%和3.34%。椰乳、水解乳蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)也被用于山茶科植物的組織培養(yǎng)中。譚和平等通過茶樹腋芽的誘導(dǎo)分化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水解乳蛋白的加入可明顯促進(jìn)芽的誘導(dǎo)。山茶科植物組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)只需單獨(dú)添加生長(zhǎng)素ba或naa就能有效地生根。畢方鋮等在}由茶的生根培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，naa7mg/l或ba6～7mg/l得到較好的生根效果，但獲得的再生苗大多只有一條主根，須根很少。
5山茶科植物組織培養(yǎng)及植株再生中存在的問題
5.1山茶科植物組織培養(yǎng)中的褐變
山茶科植物中酚類物質(zhì)含量較高，酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素合成的前體。因此，當(dāng)酚類化合物含量高時(shí)，木質(zhì)素、單寧或色素形成就多，易導(dǎo)致褐變的發(fā)生，有些細(xì)胞會(huì)因褐變而死亡。較高的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中較高濃度的無機(jī)鹽、較高濃度的激素及木質(zhì)化程度高的外植體都會(huì)促進(jìn)褐變的發(fā)生。闕生全等在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以油茶莖段作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，隨著基本培養(yǎng)基中無機(jī)鹽離子濃度的降低，褐化現(xiàn)象減輕。在培養(yǎng)基中加入吸附劑能有效抑制褐化的發(fā)生。通過吸附劑活性炭、pvp和3種抗氧化劑(維生素c、naso，和檸檬酸)對(duì)褐化的影響對(duì)比發(fā)現(xiàn)，加入吸附劑(活性炭)的培養(yǎng)基效果最好，隨著其濃度的升高，抗褐化效果提高。另外，接種后暗處理，可在一定程度上減輕褐化反應(yīng)。
5.2山茶科植物組織培養(yǎng)中的污染問題能否有效控制微生物污染是組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。在山茶科植物組織培養(yǎng)中污染可分為外植體、培養(yǎng)基和無菌操作3個(gè)方面，其中以外植體方面的污染最復(fù)雜，也最難控制。通常在春季2～3月份和秋冬季腋芽在培養(yǎng)基上容易萌發(fā)，且污染現(xiàn)象不明顯;而在夏季腋芽不僅不容易萌發(fā)且容易污染。究其原因，一方面可能與外植體的季節(jié)性帶菌情況有關(guān);另一方面可能與外植體的生理狀態(tài)有關(guān)。此外，外植體消毒劑的選擇和消毒時(shí)間的選擇也影響污染情況。在油茶組織培養(yǎng)中，用25%次氯酸鈉消毒20min對(duì)油茶腋芽消毒效果最好，芽的萌發(fā)誘導(dǎo)率達(dá)85%。
6小結(jié)與展望
山茶科植物的組織培養(yǎng)研究中，除了油茶、茶樹等少數(shù)植物相對(duì)成熟外，還有許多種植物仍處于探索階段。大多數(shù)植物的誘導(dǎo)率、增殖率、生根率等都不高，離實(shí)際應(yīng)用還有一定的差距;體細(xì)胞胚胎發(fā)生、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)培養(yǎng)的研究更有待于加強(qiáng)。山茶科植物組織培養(yǎng)研究的前景十分廣闊，很多山茶科植物都具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和造園價(jià)值。因此。通過組培快繁技術(shù)實(shí)現(xiàn)山茶科植物的大規(guī)模生產(chǎn)，不但可以提高它們的應(yīng)用價(jià)值，而且對(duì)物種資源保護(hù)和種群擴(kuò)大有著重大的意義。